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目的研究癌基因PIK3CA与PIK3CB在大肠癌组织中的表达特点及其相互关系,并通过干扰PIK3CA与PIK3CB基因在大肠癌细胞系HCT116中的表达,分析两者在PI3K/AKT细胞信号转导通路中的调控作用及其相关性,探讨其对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响,从而进一步揭示肿瘤的发生机制,为临床大肠癌的治疗提供新的靶点。实验材料1、收集病例,阅片分组收集滨州医学院附属医院2002年8月～2011年12月间手术切除的大肠癌病变标本300例,均为首次发现,术前未经任何治疗。其中高分化183例,中低分化117例；有淋巴结转移180例,无转移120例。按国际癌症防治联合会(UICC)2006年TNM分期标准,I期和II期共234例,Ⅲ期和Ⅳ期共66例,设病变旁的正常大肠黏膜组织200例为对照组。随机抽查其中125例大肠癌患者进行回访。2、细胞培养及实验细胞制备人大肠癌细胞系HCT116购自上海吉凯基因化学技术有限公司,用含10%FBS的DMEM培养基,37℃,5%CO2湿润培养,慢病毒载体转染,siRNA由上海吉马生物技术工程公司合成。经转染后成功制备细胞模型,将实验细胞分为5组,分别为空白对照组、无义序列干扰组、PIK3CA干扰组、PIK3CB干扰组、联合干扰组(PIK3CA、CB同时干扰),分别标记为A-E。实验方法1、随访随机回访上述收集病例中的200例大肠癌术后患者,除去非肿瘤原因死亡的病例,其中获得完整随访资料的125例,将随访资料与免疫组化检测的PIK3CA、 PIK3CB蛋白表达等各项检测数据用Kaplan-Meier法进行生存分析。2、免疫组织化学检测PIK3CA与PIK3CB蛋白的表达采用免疫组化方法检测PDC3CA与PIK3CB蛋白在大肠癌组织中的表达,探讨PIK3CA与PIK3CB蛋白在大肠癌组织及正常大肠黏膜组织中的表达特点,并分析两者在大肠癌变过程中表达的相互关系。3、RT-PCR检测PIK3CA与PIK3CB mRNA的表达采用RT-PCR技术检测大肠癌组织中PIKC3CA与PIK3CB mRNA的表达及其与正常大肠黏膜组织的差异,分析PIK3CA与PIK3CB表达的相关性。检测细胞培养各组大肠癌细胞中PIK3CA与PIK3CB mRNA的表达情况。4、Western blot检测PIK3CA与PIK3CB蛋白的表达采用Western blot技术在大肠癌组织及细胞培养各组大肠癌HCT116细胞中检测PIK3CA与PIK3CB蛋白的表达情况,并分析PIK3CA与PIK3CB蛋白的表达差异及相互关系。5、CCK-8(Cell Counting Kit-8)分析细胞增殖活性将各组细胞加入CCK-8染液后培养,用酶标仪测定在450nm处的吸光度,记录24h、48h、72h和96h四个时间点的吸光度值(A值),然后绘制细胞增殖曲线,分析细胞增殖活性。6、流式细胞术检测细胞周期和DNA倍体情况将各组细胞培养48h后制成细胞悬液,用流式细胞仪分析细胞周期中各期细胞的百分比及DNA倍体变化,检测细胞增殖与凋亡。7、细胞免疫荧光检测蛋白表达用免疫荧光染色法分析各组细胞中PIK3CA、PIK3CB、BCL-2蛋白的表达情况,结果用平均荧光灰度值表示。结果1、随访结果及生存分析200例大肠癌病例中,除去非肿瘤原因死亡的患者,获得完整随访资料125例,其中女性60例(48%),男性65例(52%)；35～45岁8例,46-55岁26例,56～65岁33例,66～75岁43例,>75岁15例；高分化36例,中低分化89例；I、II期76例,Ⅲ、Ⅳ期49例。死亡患者共29例,其中女性13例,男性16例；35～45岁0例,46～55岁3例,56～65岁6例,66～75岁11例,>75岁9例；高分化8例,中低分化21例；I、II期7例,Ⅲ、Ⅳ期22例。生存分析结果显示,PIK3CA阳性PIK3CB阳性组、PIK3CA阳性PIK3CB阴性组、PIK3CA阴性PIK3CB阳性组、PIK3CA阴性PIK3CB阴性组4组的平均生活时间分别41.7、44.9、48.1、60.5个月,表明PIK3CA与PIK3CB高表达与患者死亡风险有明显相关性。2、在大肠癌组织中癌基因PIK3CA与PIK3CB的表达具有相关性,并与患者的预后有关。在300例大肠癌蜡块组织中PIK3CA与PIK3CB表达的平均光密度分别是10.0879±2.1487、15.8706±2.8777,均高于正常黏膜组织,差异具有统计学意义(p<0.05),且PIK3CA与PIK3CB在大肠癌组织中的表达具有相关性(r=0.68,p<0.05)；RT-PCR检测结果显示,与正常大肠黏膜组织相比,大肠癌组织中PIK3CA与PIK3CB在mRNA水平表达均明显升高,且表达呈正相关关系(r=0.74,p<0.05)：Western blot发现PIK3CA与PIK3CB在蛋白水平同样表达升高,二者表达也具有正相关性(r=0.71,p<0.05)。3、靶向干扰大肠癌HCT116细胞后,PIK3CA与PIK3CB mRNA和蛋白的表达变化在5组大肠癌HCT116细胞中,与空白对照组相比,靶向干扰PIK3CA组PIK3CB mRNA和蛋白的表达有所下降,但无统计学意义(p>0.05)；靶向干扰PIK3CB组PIK3CA mRNA和蛋白的表达亦有所下降,亦无统计学意义(p>0.05)；联合干扰组与其余4组比较,PIK3CA、PIK3CB mRNA和蛋白的表达明显降低,其差异有统计学意义(p<0.05)。4、靶向干扰大肠癌细胞HCT116中的PIK3CA与PIK3CB基因表达可影响大肠癌细胞的增殖。CCK-8实验显示各实验组细胞的平均吸光度值不同,差异具有统计学意义(p<0.05),说明通过干扰大肠癌HCT116细胞中PIK3CA与PIK3CB基因的表达,可以影响细胞的增殖能力。用流式细胞术检测各实验组的细胞周期情况,结果显示,靶向干扰组细胞周期S期所占比例有不同程度降低,靶向干扰组各组与其他组比较其差异具有统计学意义(p<0.05),尤其是联合干扰组,与对照组比较,可以显著影响细胞的增殖能力(p<0.01)。5、靶向干扰大肠癌细胞HCT116中PIK3CA与PIK3CB的基因表达可影响细胞的凋亡。流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况,结果显示,靶向干扰组各组与其他组比较DNA亚二倍体峰(凋亡峰)明显增高,其差异具有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光染色法检测BCL-2蛋白的表达结果显示,靶向干扰组各组较其他组BCL-2蛋白的表达降低,尤其是联合干扰组,BCL-2降低显著,细胞凋亡明显增多,与其他干预组比较差异具有显著性(p<0.05)。结论1、PIK3CA与PIK3CB在大肠癌组织中高表达,与正常黏膜组织比较有明显差异,PIK3CA与PIK3CB在大肠癌的发生、发展过程中具有协同作用,且PIK3CA与PIK3CB的高表达是影响大肠癌患者预后的相关因素。2、靶向PIK3CA与PIK3CB的siRNA技术抑制大肠癌细胞中PIK3CA与PIK3CB的表达,可抑制肿瘤细胞的生长、增殖,促进细胞凋亡,有可能成为大肠癌基因治疗的新靶点。3、PIK3CA与PIK3CB基因在大肠癌变的过程中有共同作用,两者同为P110的亚单位在一定程度上虽有相互影响,但无明显的相互调控关系,而是各自在不同的途径发挥促进细胞癌变的作用。