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背景和目的牙周病治疗的最终目标是重建因炎症过程而破坏的牙周组织,恢复牙周组织的结构和功能,即实现牙周组织的再生。组织的修复再生过程在很大程度上是生长发育过程的重演,因此明确组织形成的细胞学和分子学机制,对探索牙周组织再生非常重要。目前一般认为,牙周组织发生的前体细胞由牙囊细胞分化而来。研究表明,牙囊细胞中含有成牙骨质细胞、牙周膜成纤维细胞和成骨细胞的前体细胞,在牙齿发育后期能形成牙骨质、牙周膜及牙槽骨。因此,深入研究发育过程中调控牙囊细胞分化的特异性因子及机制可为研究牙周组织再生所需要的细胞和分子提供重要的信息。牙囊发育为成熟的牙周组织是一个非常复杂的过程,涉及多种细胞的分化,需要许多因子调控。其中转录因子核心结合因子α1(Core binding factorα1,Cbfa1),作为成骨细胞分化和骨发育的控制基因(master gene)备受关注。Cbfa1对牙齿的发育同样有重要作用。Cbfa1缺失鼠磨牙在帽状早期停止发育,Cbfa1突变导致的颅锁骨发育不良综合征,除表现为骨形成异常外,也有很多牙齿疾患,如多生牙,恒牙萌出延迟,细胞性牙骨质缺失和牙根外形异常等。另外,Cbfa1在牙囊和牙乳头中都有表达,而且随着牙齿的进一步发育和牙根、牙周组织的形成,Cbfa1的表达更为明显,在成牙骨质细胞、牙骨质细胞、牙周韧带成纤维细胞和成骨细胞中都有表达。这表明Cbfa1参与牙周细胞的分化和牙周组织的形成。研究发现,非成骨细胞中Cbfa1超表达能诱导成骨特异性基因表达,如I型胶原(collagen I,Col I)、骨桥素(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙素(osteocalcin,OC)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等;成骨细胞中,用反义核酸干扰Cbfa1表达抑制了成骨细胞分化标记基因的表达和矿化结节的形成;而且,多种成骨细胞相关基因的启动子都具有Cbfa1结合位点。这些基因都是成骨细胞和成牙骨质细胞的重要组分,表明Cbfa1可能通过调控这些成骨/成牙骨质相关基因的表达对成骨细胞/成牙骨质细胞有重要作用。然而,Cbfa1对牙周组织的发育,对分化形成牙周组织的牙囊细胞的调控作用尚不明确。骨形成蛋白-2(bone morphogenic protein-2,BMP-2)是转录生长因子-β超家族的成员之一,是研究最多的牙周组织再生的促进因子之一。研究表明,BMP-2能有效促进骨和牙骨质形成。然而,BMP-2半衰期短,靶向性差,能扩散作用于周围的非骨组织,而且靶细胞表面需要特异性受体和辅助因子,这些都限制了BMP-2功能的发挥。目前,牙周组织再生中,BMP-2的应用需要进一步的深入研究。因此,本研究采用逆转录病毒系统,将Cbfa1导入牙囊细胞,使其在牙囊细胞中稳定超表达,观察Cbfa1对牙囊细胞分化的调控作用。同时比较Cbfa1和BMP-2转染牙囊细胞的生物学活性,以期为牙周组织发育和牙周组织再生提供一定的细胞分子生物学信息。材料和方法1.Cbfa1在小鼠牙囊细胞中的表达取出生后5～7天BALB/c小鼠,分离解剖含下颌第一磨牙牙胚的下颌骨,制备组织切片,采用免疫组化和原位杂交方法,观察Cbfa1蛋白和mRNA在牙囊细胞中的组织学定位;随后体视显微镜下取出生后5～7天BALB/c小鼠下颌第一磨牙的牙囊组织,原代培养牙囊细胞,分别提取牙囊细胞的总RNA和蛋白,采用RT-PCR和Western blot法观察Cbfal mRNA和蛋白在体外培养牙囊细胞中的表达情况。2.超表达Cbfa1对牙囊细胞向成骨/成牙骨质细胞方向分化的影响构建Cbfa1逆转录病毒表达载体pLEGFP-IRES-Cbfa1,用脂质体法转入逆转录病毒包装细胞PT67,G418筛选获得稳定的产毒细胞株;然后用含Cbfa1病毒的培养液感染牙囊细胞,抗生素筛选获得稳定超表达Cbfa1的牙囊细胞;采用实时RT-PCR检测超表达Cbfa1对牙囊细胞中成骨/成牙骨质相关基因的作用,包括ALP、OC、OPN、BSP、Col I、牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)和牙骨质蛋白(cementum-derived protein 23,CP23)等,同时采用体外矿化结节形成实验检测超表达Cbfa1对牙囊细胞体外矿化能力的影响,实验以正常牙囊细胞和感染逆转录病毒空载体的牙囊细胞作对照。通过删除Cbfa1转录抑制区VWRPY元件构建增强型Cbfa1逆转录病毒表达载体pLEGFP-IRES-Cbfa1(E),并获得稳定超表达增强型Cbfa1的牙囊细胞,观察增强型Cbfa1对牙囊细胞中成骨/成牙骨质相关基因的作用和对牙囊细胞体外矿化能力的影响。3.牙囊细胞中Cbfa1、BMP-2超表达对成骨/成牙骨质相关基因表达影响的比较构建BMP-2逆转录病毒,并用Cbfa1、BMP-2逆转录病毒分别感染牙囊细胞,获得稳定超表达Cbfa1、BMP-2的牙囊细胞。采用实时RT-PCR和体外矿化结节形成实验检测并比较超表达Cbfa1和BMP-2对牙囊细胞中成骨/成牙骨质相关基因的作用和对牙囊细胞体外矿化能力的影响。实验以正常牙囊细胞和感染逆转录病毒空载体的牙囊细胞作对照。结果1.Cbfa1在小鼠牙囊细胞中的表达出生后5～7天BALB/c小鼠下颌第一磨牙牙胚处于钟状晚期,上皮根鞘清晰可见,牙根还没有开始发育,牙囊组织疏松的环绕在成釉器周围。组织学观察发现,Cbfa1 mRNA在牙囊细胞的胞浆中有表达,但Cbfa1蛋白在牙囊组织中未见表达。对体外培养的牙囊细胞,RT-PCR检测发现Cbfa1 mRNA在培养牙囊细胞中阳性表达,Western blot检测未见Cbfa1蛋白表达,与体内牙囊细胞的检测结果相一致。2.超表达Cbfa1促进牙囊细胞向成骨/成牙骨质细胞方向分化构建的Cbfa1重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-IRES-Cbfa1经酶切电泳分析和序列测定,插入的Cbfa1片段与GeneBank中Cbfa1序列完全一致,质粒构建成功。将包装细胞PT67包装形成的Cbfa1逆转录病毒感染牙囊细胞,G418筛选获得稳定超表达Cbfa1的牙囊细胞。感染细胞在荧光显微镜下可见有绿色荧光,实时RT-PCR发现Cbfa1病毒感染细胞中Cbfa1 mRNA表达量明显升高(P＜0.01),是正常和空载体感染细胞的5～10倍,并能检测到Cbfa1蛋白表达,稳定超表达Cbfa1的牙囊细胞构建成功。牙囊细胞中可检测到成骨/成牙骨质相关基因(ColI、ALP、OPN、BSP、OC、CAP和CP23)的表达。Cbfa1超表达牙囊细胞中成骨/成牙骨质相关基因(OC、BSP、OPN、ColI、CAP和CP23)的表达显著高于正常牙囊细胞和感染逆转录病毒空载体的牙囊细胞(P＜0.01);而ALP的表达受到抑制(P＜0.01)。Cbfa1(E)对部分成骨/成牙骨质相关基因(OC、OPN、Col I和CP23)表达的促进作用强于Cbfa1(P＜0.01),而Cbfa1对CAP的促进作用强于Cbfa1(E)(P＜0.01),二者对BSP和ALP的作用无明显差异(P＞0.05)。矿化结节形成实验观察到,牙囊细胞和病毒感染牙囊细胞中均有黑褐色的矿化结节形成,且随着培养时间增长,形成的矿化结节逐渐增多。Cbfa1感染牙囊细胞中,矿化结节的量明显多于正常牙囊细胞和感染逆转录病毒空载体的牙囊细胞(P＜0.01),而Cbfa1(E)对矿化结节形成的增强能力大于Cbfa1(P＜0.05)。3.牙囊细胞中Cbfa1、BMP-2超表达对成骨/成牙骨质相关基因表达影响的比较BMP-2重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-IRES-BMP-2经酶切电泳分析和序列测定,插入的BMP-2片段与GeneBank中BMP-2序列完全一致,质粒构建成功。将包装细胞PT67包装形成的Cbfa1、BMP-2逆转录病毒分别感染牙囊细胞,G418筛选获得稳定超表达Cbfa1、BMP-2的牙囊细胞。感染细胞在荧光显微镜下可见有绿色荧光,实时RT-PCR发现感染细胞中,目的基因表达量明显升高(P＜0.01),是正常和空载体感染细胞的5倍,并能检测到相应蛋白的表达。实时RT-PCR分析显示,Cbfa1感染牙囊细胞中BSP、OPN、Col I和CAP的表达强于BMP-2感染牙囊细胞(P＜0.01),而BMP-2感染牙囊细胞中CP23的表达高于Cbfal感染牙囊细胞(P＜0.01)。超表达Cbfa1、BMP-2牙囊细胞中,ALP表达均有所降低(P＜0.01),Cbfa1对ALP表达的抑制作用强于BMP-2(P＜0.01)。Cbfa1和BMP-2对OC表达的影响均不明显(P＞0.05)。矿化结节形成实验观察到,Cbfa1感染牙囊细胞中矿化结节的量明显多于BMP-2感染牙囊细胞(P＜0.01),BMP-2感染牙囊细胞中形成的矿化结节与正常牙囊细胞和逆转录病毒空载体感染的牙囊无明显差异(P＞0.05)。结论1.用逆转录病毒表达系统,成功构建了超表达Cbfa1、BMP-2的牙囊细胞。2.Cbfa1可能通过调节成骨/成牙骨质相关基因(OC、OPN、BSP、ColI、CAP、CP23等)的表达促进牙囊细胞向成骨细胞/成牙骨质细胞方向分化,而且删除了转录抑制区VWRPY元件的增强型Cbfa1的促进能力更强。3.应用逆转录病毒表达系统,牙囊细胞中超表达Cbfa1比BMP-2更能促进成骨/成牙骨质相关基因的表达。