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帕金森氏病(PD)是第二常见的与年龄相关的神经变性疾病。近年来,诸多研究表明microRNA-7(miR-7)在帕金森氏病中发挥着非常重要的保护作用。然而, miR-7的生物学作用和在PD中的分子机制仍不清楚。本研究拟利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对多巴胺能神经元的毒性作用,采用不同剂量的MPP+诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞发生细胞凋亡,建立稳定的急性PD细胞模型。该研究通过采用流式细胞术、原位末段标记(TUNE L)检测DNA断裂、JC-1染色检测线粒体膜电位(ΔΨm)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性检测以及核小体的富集程度等多种手段对细胞凋亡的检测,充分证明了miR-7在PD细胞模型中发挥的保护作用,高表达的niR-7可以有效抑制MPP+诱导的神经细胞凋亡,减少末端转移酶介导的缺口末端标记阳性率,降低线粒体膜电位,减弱caspase 3的活性和核小体的富集程度。Bax和沉默调节蛋白2(SIRT2)是的miR-7的直接靶基因。此外,通过分别过表达Bax和Sirt2,可以抵消miR-7的作用。Bax和Sirt2下游相关分子的表达也参与了miR-7对MPP+诱导的神经细胞凋亡的调控作用。这些发现无疑揭开了PD治疗的新篇章,有潜在的应用意义。第一部分建立稳定的急性帕金森病细胞模型研究方法1.采用不同浓度IPP+(0、1、2、4mM)作用于SH-SY5Y细胞,作用时间持续24 h,最终选取合适浓度的MPP+作用于SH-SY5Y细胞,建立帕金森病的细胞模型。2.针对已建立的帕金森病细胞模型,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。3.采用活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧水平。4.乳酸脱氢酶释放检测试剂盒检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性。结果1.加入不同浓度的MPP+时,SH-SY5Y细胞中细胞活性随MPP+浓度增加而下降。2.采用浓度为4 mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞建立帕金森病的细胞模型。3.mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞时,细胞内活性氧水平明显升高。4.mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞时释放的乳酸脱氢酶活性明显升高。结论4 mM的MPP+作用于SH-SY5Y细胞时极大的影响了细胞的活性,促进细胞内活性氧的生成,细胞所释放乳酸脱氢酶的活性明显升高,可建立稳定的急性帕金森损伤模型。第二部分上调miR-7表达对帕金森病的细胞模型生物学作用的影响研究方法1.加入不同浓度的MPP+ 的 SH-SY5Y细胞,分别转染miR-7 mimics和miR-NC, CCK-8法检测各组细胞增殖和生长能力。2.将细胞分为四组：空白组(miR-NC转染的SH-SY5Y细胞),实验组(miR-7 mimics转染的SH-SY5Y细胞),模型组(4mM 的 MPP+作用SH-SY5Y细胞,转染miR-NC),治疗组(4mM的MPP+作用SH-SY5Y细胞,转染miR-7).3.活性氧检测试剂盒、乳酸脱氢酶释放检测试剂盒检测细胞毒性。4. AnncxinV-FITC/PI双标记流式细胞术、原位末段标记(TUNEL)检测DNA断裂、JC-1染色检测线粒体膜电位(△Ψm)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性检测以及核小体的富集程度检测细胞凋亡。结果1.miR-7明显提高不同浓度处理的MPP+的SH-SY5Y细胞的活性。2.miR-7降低MPP+作用于SH-SY5Y细胞所产生的细胞毒性。3.miR-7显著抑制帕金森病细胞模型中SH-SY5Y细胞的凋亡。结论miR-7可抑制MPP+所诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的凋亡,降低其对细胞的毒性作用。因此, miR-7可以作为一种神经保护剂,为缓解和治疗帕金森病提供了新的策略和潜在的可能性。第三部分miR-7在帕金森病细胞模型中靶基因的预测与验证研究方法1.采用TargetScan, miRanda和PicTar等靶基因预测软件,预测miR-7可能靶向Bax和Sirt2基因。2.构建野生型和突变型Bax和Sirt2基因3’-UTR片段双荧光素酶报告载体,并分别与miR-7或miR-NC质粒共转染SH-SY5Y细胞,检测荧光值。3.在帕金森病细胞模型的SH-SY5Y细胞中转染miR-NC、 miR-7mimics,分别采用qPCR和Western blo t检测Bax和Sirt2 mRNA和Bax和Sirt2蛋白的表达变化。结果1. Bax和Sirt2基因3’-UTR各有一个序列片段可能与miR-7结合。2.双荧光素酶实验显示,miR-7高表达可显著抑制转染Bax和Sirt2野生型片段细胞的荧光素表达；而当将结合位点突变后,上述抑制作用丧失。3. miR-7高表达抑制Bax 和 Sirt2基因mRNA和蛋白表达。结论miR-7可靶向抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞Bax和Sirt2基因的表达,并在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中1niR-7与Bax和Sirt2基因mRNA和蛋白表达均呈负相关,miR-7在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中的低表达与Bax和Sirt2所参与的细胞凋亡通路有关。第四部分miR-7 对 Bax 和 Sirt2转录后调控作用机制的研究研究方法1.在不同浓度MPP+处理的SH-SY5Y细胞中单独或共转染miR-7和Sirt2, Western blot检测Sirt2 和 Bim。2.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性检测细胞凋亡。3.在SH-SY5 Y细胞中单独或共转染miR-7和Bax, Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2, Bax, Cl-caspase 3和Cyt c的表达。4.线粒体膜电位(△Ψm)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性以及核小体的富集程度检测细胞凋亡。结果1.在SH-SY5Y细胞模型中高表达miR-7可抑制Bax和Sirt2的表达；共转染miR-7和Bax或Sirt2,外源性Bax或Sirt2的表达减弱miR-7对MPP+处理的SH-SY5Y细胞模型的保护作用。2.高表达miR-7抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,共转染Bax或Sirt2可逆转这一现象。3.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性检测、JC-1染色检测线粒体膜电位(△Ψm)、以及核小体的富集程度均显示共转染Bax或Sirt2可逆转miR-7对SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。4.在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中,高表达miR-7抑制SH-SY5Y细胞中促凋亡蛋白Bim, Cl-caspase 3和Cyt c的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,共转染Bax或Sirt2则促进Bim, Cl-caspase 3和Cyt c的表达,抑制Bcl-2的表达。结论miR-7作为帕金森病潜在的保护基因,可通过其靶基因Bax和Sirt2调控细胞凋亡信号通路,抑制神经元细胞的凋亡。miR-7通过抑制其靶基因Bax和Sirt2的表达,影响凋亡相关分子的表达,进而发挥对细胞凋亡的抑制作用,可能为利用microRNAs治疗帕金森病提供一定的理论依据。