镉胁迫下两个红麻品种形态、生理响应及差异基因发掘

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红麻(HibiscuscannabinusL.)是双子叶植物纲,锦葵科木槿属一年生草本韧皮纤维作物,其生命力非常强,并且对重金属有很高的耐受性和富集能力,是一种潜在的重要的土壤重金属修复植物。近年来,我国农田土壤重金属污染面积逐渐增加,时刻威胁着农作物和人类的身体健康。目前,国内关于红麻非生物胁迫的研究还比较少,更未有见关于红麻响应Cd胁迫的分子机理研究的报道。为了研究Cd对红麻响应的分子机制,本研究以福红991(FH)和云南元江(YN)两个红麻品种为材料,育苗20天左右时,使用0、10、30mg/kg的CdC12处理幼苗,一周后测定不同浓度下幼苗的农艺性状、生理指标、根系活力的变化,并测定两个品种在不同处理下对Cd的富集状况,并利用透射电子显微技术观察两个品种在0、10mg/kg Cd2+处理下的根和叶片细胞超微结构;同时,将两个品种在0、10mg/kg Cd2+处理下的叶片进行转录组测序分析。得到如下结果:(1)通过测量红麻幼苗株高、茎粗、根长、各部分鲜重、干重等指标来反应重金属Cd对FH和YN两个红麻品种的影响。研究发现,Cd对红麻的毒害作用非常严重,造成根、茎等组织器官生长缓慢,叶片出现失绿、卷曲甚至脱落等现象;并且,随着Cd处理浓度的升高,各项农艺性状指标的相对抑制率均显著升高,且FH品种各项指标相对抑制率均小于YN。(2)胁迫处理一周后,分别测定FH、YN两品种红麻叶片SOD、POD、CAT酶活性和MDA含量,同时测定其根系活力,发现在0~30mg/kg范围内,随着Cd胁迫浓度的升高,SOD、MDA、根系活力总体均逐渐升高,POD活性呈先上升后下降的趋势,CAT活性表现为逐渐下降趋势,各项指标的变化趋势非常明显,在不同浓度下FH品种SOD、POD活性均高于YN品种,MDA、根系活力、CAT活性均低于YN品种。(3)胁迫一周后,测定在不同处理下两个红麻品种不同部位的Cd含量,通过分析发现红麻对重金属Cd的富集程度表现出根>茎>叶,且同一处理下,FH品种根、茎、叶中Cd含量均高于YN,即FH品种对Cd的富集能力高于YN。在0~30mg/kg处理范围内,Cd在FH和YN两品种红麻根中的含量呈逐渐增加的趋势,在茎和叶中的含量呈先上升后下降的趋势;当Cd2+处理浓度为30mg/kg时两品种红麻根中的Cd含量均达最大值,FH为2836 mg/kg,YN为2976 mg/kg;茎中Cd含量在10mg/kg处理时达到最大值,FH为320 mg/kg,YN为278 mg/kg;叶中的Cd含量同样在10mg/kg处理时达到最大值,FH为119 mg/kg,YN为96 mg/kg。(4)本试验使用透射电子显微镜(TEM)观察了FH和YN两个品种在Cd胁迫处理一周后的根和叶片的超微结构。通过分析发现,与对照组片相比,10mg/kg Cd2+处理下FH和YN品种的根细胞结构遭到破坏,细胞壁增厚,核膜模糊不清,染色质颜色变浅,同浓度下叶片细胞叶绿体类囊体薄膜结构松散或消失,出现内溶物外泄等现象;同时比较10mg/kg Cd2+处理下两品种红麻叶片细胞超微结构发现,YN品种叶片叶绿体受到的破坏程度更为严重,已经找不到特征明显的叶绿体,即从细胞学水平反映出在10mg/kg Cd2+处理下YN比FH对于重金属Cd的敏感性更高。(5)将FH和YN两个品种的叶片做转录组测序,组装共得到199762个Transcripts和 105437个Unigene。FH10与FHO相比共有2219个差异表达的基因,YN10与YN0相比有3320个差异表达的基因,其中两个品种共有的差异表达基因有525个基因,YN品种受到Cd胁迫后基因变化的数目更多,YN对重金属Cd胁迫的敏感性更高;对共有的差异基因进行GO富集分析发现,其主要富集在“细胞组成”、“抗氧化酶活性”和“锌铁结合转运”等功能方面。共有的差异表达基因进行KEGG代谢通路富集,发现其主要富集在“羧酸代谢途径”、“MAPK信号通路”、“氨基酸代谢通路”、“MAPK信号通路”等代谢通路当中。(6)以RNA为模板克隆得到CXE1,MTP4,ZIP2,MT,MT2,ERF2,ERF5基因序列。采用双酶切法成功构建CXE1,MTP4,ZIP2,MT,MT2,ERF2,ERF5的过表达载体。并已利用烟草的遗传转化体系,使用农杆菌介导叶盘法成功将构建好的CXE1基因的过表达载体转入烟草中,通过分子检测获得一批转基因植株。
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