研究背景和目的结直肠癌是一种消化系统常见的恶性肿瘤,其发病率和肿瘤相关死亡率位居所有肿瘤的第三位。结直肠癌早期表现不明显,往往出现症状就到了晚期且容易发生转移,预后较差,是其病死率较高的主要原因。目前,对其发生和转移的具体分子机制还未完全清楚。现在认为有多个基因参与疾病的发生过程。像癌基因Ras的激活,抑癌基因P53的失活,APC的突变等,这些基因都是编码基因。随着基因组和基因芯片的研究技术的发展,通过基因组测序,发现了一些基因编码RNA,但这些RNA不能翻译成蛋白质,称为非编码RNA(Non-coding RNA)。非编码 RNA 包括 rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 和 microRNA 等多种已知功能的RNA和未知功能的RNA。其中一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们不能编码蛋白,而是以RNA的形式在多个层面上(表观遗传调控、转录时的调控以及转录后水平的调控等)来调控基因的表达水平被称为长链非编码RNA(lncRNA)。相对于蛋白编码序列以及microRNA,lncRNA的研究还仅仅只是处于起步的阶段,lncRNA刚被发现时被认为是基因组转录的“噪音”,不具有生物学的功能,只是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物。近年来的研究表明,lncRNA在调控细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡等方面都有重要作用。lncRNA的异常表达与人类疾病密切相关,尤其在肿瘤方面。现已在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多种肿瘤中发现lncRNA异常表达,且这些lncRNA参与肿瘤的发生、生长、浸润、转移及复发的过程,提示lncRNA在肿瘤的发生发展过程中可能充当着癌基因或抑癌基因的角色。非编码RNA中microRNA(miRNA)研究的已经比较多了,而lncRNA研究较少,对其起在疾病中的功能作用还是不清楚。目前,对于lncRNA在大肠癌中的研究,只是发现了少数几种与大肠癌相关的lncRNA,仍只属于冰山一角,且这些发现的lncRNA具体功能还不清,绝大数lncRNA在疾病中的分子调控机制仍不明确。因此,有必要继续探寻与大肠癌相关异常表达的lncRNA,并探索其功能,进一步挖掘其分子生物学机制,从而更加完善大肠癌的分子基础研究。CASC11是新发现的基因,关于其功能尚无相关报道。CASC11周围还分布着许多其他的长链非编码基因,且这些基因都和肿瘤的发生发展相关。在结直肠癌中CCAT1位于c-Myc基因启动子的增强子区域可以促进c-Myc的表达;同时c-Myc在肝细胞癌中可以作为转录因子结合于CCAT1启动区域促进CCAT1的表达;CCAT2可以激活WNT通路并调控c-Myc的表达;PVT1和c-Myc在肿瘤中存在共扩增现象,且拷贝数的增加互为依赖,可以通过调控c-Myc表达促进胰腺癌发生发展。有文献报道lncRNA作用机制依赖于他们的基因组位置,特别是与相邻基因的位置关系。CASC11是距离c-Myc最近的基因,并且与c-Myc互为启动子区域,且有文献报道SNP位点16902359与淋巴瘤相关,通过查阅NCBI数据库我们发现这个位点属于CASC11基因转录本覆盖范围。因此,我们推测CASC11也是有功能的,其发挥作用的机制可能也是和c-Myc相关。本课题拟检测CASC11在结直肠癌中的表达情况;分析其表达量的改变与临床病理参数之间的关系;通过体内外实验,验证其在结直肠癌中的功能作用;并研究CASC11在结直肠癌中的具体作用机制;探讨CASC11异常表达的上游调控机制。研究方法1.CASC11在结直肠癌组织及细胞中的表达情况(1)采用荧光实时定量 PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测 36 例结直肠癌组织标本及其配对的正常组织中CASC11的表达。检测CASC11在结肠癌细胞株SW480、SW620、HT29、LOVO、Ls174t、RKO、M5、HCT116 和永生化结肠上皮细胞 FHC中的表达情况。(2)根据临床样本资料分析CASC11在组织样品中的表达情况与肿瘤大小、分期和转移等相关临床病理参数的关系。2.CASC11对结直肠癌体内外生物学特性的影响(1)购买了 CASC11稳定干扰的慢病毒载体及构建了 CASC11过表达的质粒,经测序鉴定,结果显示无突变、缺失,序列完全正确。将病毒转染至SW480和SW620细胞中,建立稳定干扰CASC11表达的SW480和SW620细胞亚系。将过表达质粒转染至SW620、RKO细胞系中,构建瞬时过表达CASC11的细胞亚系。并用qRT-PCR的方法进行验证。(2)通过CCK8细胞增殖实验,平板克隆实验,流式细胞术,Transwell实验、划痕实验检测干扰或过表达CASC11的细胞株体外增殖和迁移能力。(3)将已构建成功的稳定干扰细胞株SW480-pLV-shCASC11和SW480-PLV-shNC注射至裸鼠皮下,4周后检测肿瘤的大小以观察CASC11稳定干扰的细胞株在体内的增殖能力;尾静脉注射以建立CASC11干扰细胞株的体内转移模型,并于8周后检测裸鼠肝脏和肺脏的转移情况。3.CASC11与靶基因之间的相互作用(1)通过RNA-pull-down实验拉下CASC11基因的结合蛋白,经过银染质谱分析,结合文献选出感兴趣的结合蛋白不均一核糖体蛋白K(Heterogeneous ribonucleoprotein K,hnRNP-K),并用Western blot和RIP实验鉴定二者之间的结合。(2)干扰或过表达CASC11,检测hnRNP-K的表达量改变。观察CASC11是否对hnRNP-K有调节作用。(3)通过核浆RNA分离实验,观察CASC11在结肠癌细胞中的定位,根据其定位于胞浆或胞核结合相关文献推测其功能机制。加入放线菌酮D后检测CASC11的改变对hnRNP-K稳定性的影响。(4)改变hnRNP-K的表达,检测CASC11表达的改变,观察hnRNP-K是否对CASC11有反作用。通过qRT-PCR和IHC的方法检测结直肠癌组织中hnRNP-K的表达情况,并分析CASC11和hnRNP-K之间的相关性,进一步明确CASC11与hnRNP-K之间的相互作用。4.CASCl1通过hnRNP-K对WNT通路活性的调节作用(1)通过GSEA基因富集的方法,利用公共数据库GEO数据分析结直肠癌中CASC11高表达组中上调的信号通路(WNT信号通路)。(2)通过TOP/FOP双荧光素酶报告基因检测WNT活性改变,通过qRT-PCR和Westernblot检测WNT通路靶基因的改变。(3)利用蛋白的核浆分离,检测CASC11改变后β-catenin和hnRNP-K入核量的改变。并通过进一步改变hnRNP-K的表达情况,检测CASC11对WNT信号通路的调节是否通过hnRNP-K起作用。(4)通过COIP检测hnRNP-K和WNT通路里重要蛋白的结合情况,初步推测hnRNP-K在WNT信号激活过程中的可能作用。5.结直肠癌中CASC11的上游调控机制(1)TRANSFAC网站预测CASC11启动子区域是否有c-Myc结合位点,并通过CHIP实验和双荧光素酶报告基因实验验证c-Myc是否能结合在CASC11启动子部位并促进CASC11 表达。(2)上调或下调c-Myc表达后,用qRT-PCR技术检测CASC11的表达情况,再次验证c-Myc是否能作为转录因子调节CASC11表达,并分析二者之间相关性。(3)UCSC数据库观察CASC11启动子部位有乙酰化改变,并通过CHIP实验证实乙酰化部位。检测c-Myc是否可以调节CASC11启动子区乙酰化进而调节CASC11的表达。6.统计学分析采用SPSS20.0软件进行数据分析。两组间比较用独立样本的t检验,数据表示为3次独立实验的均数±标准差的形式。如果是三组以上进行比较用单因素方差分析的方法(One-Way ANOVA),用LSD和SNK方法进行比较。CASC11表达情况和临床病理参数之间的关系采用χ2检验。CASC11与hnRNP-K在组织样本中表达量的相关性及c-Myc与hnRNP-K的相关性用相关性分析来检测。P<0.05为差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。研究结果1.CASC11在结直肠癌组织和细胞中表达上调且与结直肠癌的大小、分期和浸润转移相关。(1)CASC11在结直肠癌组织和细胞中表达上调荧光定量RT-PCR结果显示,在36对结直肠癌组织中,CASC11在结直肠癌组织中的表达有32对高于周围正常粘膜组织(P<0.001)。在结直肠癌细胞LOVO,M5,LS174t,RKO,SW620,SW480,HT29,HCT116中CASC11的表达均高于永生化结肠细胞FHC(P<0.05)。(2)CASC11表达水平和临床病理参数之间的关系临床病理分析结果显示,CASC11的表达水平在年龄、性别和分化上没有显著差异(P>0.05),而在肿瘤大小、TNM分期、局部浸润和淋巴结转移上有差异且具有统计学意义(P<0.05)。2.CASC11在结直肠癌进展过程中的作用(1)CASC11干扰和过表达载体的构建构建了 CASC11干扰的慢病毒载体和过表达CASC11的表达质粒,经测序鉴定结果显示插入的序列正确,无突变、缺失或者框移。将慢病毒载体转染结直肠癌细胞株构建了CASC111 稳定干扰的细胞株 SW480-pLV-shCASC11、SW480-PLV-shNC 和SW620-pLV-shCASC11、SW620-PLV-shNC,经 qRT-PCR 检测 CASC11 表达与对照组相比明显降低(P<0.001)。将表达质粒pEGFP-C1-CASC11转染RKO和SW620,构建瞬时过表达的细胞株,qRT-PCR检测CASC11表达与对照组相比明显升高(P<0.001)。(2)CASC11干扰和过表达对结直肠癌细胞增殖能力的影响CCK8结果显示,与对照组相比CASC11稳定干扰的细胞生长速度显著下降(P<0.001),过表达的细胞生长速度则明显快于对照组(P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示,与对照组相比CASC11稳定干扰的细胞形成的克隆数量显著减少(P<0.05)。流式细胞学结果显示,与对照组相比,稳定干扰组细胞在G1期数量显著增多。裸鼠皮下成瘤实验结果表明,与对照组相比较CASC11稳定干扰组裸鼠皮下肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积明显较小(P><0.05),并且稳定干扰组Ki67的阳性率(50%)显著低于对照组(86%)(P<0.001)。(3)CASC11干扰和过表达对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响Transwell实验结果显示,与对照组相比,CASC11干扰组细胞迁移数量明显减少(P<0.001),而CASC11过表达组细胞迁移数量明显增多(P<0.05)。划痕实验结果显示,CASC11干扰组细胞与对照组相比较,迁移速度明显减慢(P<0.001)。裸鼠尾静脉注射SW480/shNC和SW480/shCASC11细胞以观察CASC11干扰后的结直肠癌细胞在体内的转移情况,8周后,将裸鼠处死检测肝肺转移,结果显示,CASC11干扰组细胞注射的裸鼠在2个月后肝和肺均未发生转移,而对照组有4只发生肝转移,有2只发生肺转移。3.CASC11可以促进靶基因hnNRP-K的表达(1)hnRNP-K 是 CASC11 的靶基因RNA-pull down结果显示CASC11可以与hnRNP-K蛋白相结合,CASC11拉下的蛋白用hnRNP-K抗体做Westernblot验证结果为阳性。用hnRNP-K抗体做RIP,结果显示hnRNP-K抗体能结合CASC11的RNA。(2)CASC11可以调节hnRNP-K的表达CASC11干扰的细胞株分别用qRT-PCR和Westernblot检测SW480和SW620细胞中hnRNP-K的表达,实验结果显示hnRNP-K表达明显降低,相反CASC11过表达则引起hnRNP-K的表达水平增高,说明CASC11可以调节hnRNP-K表达。(3)CASC11可以增加hnRNP-K的稳定性核浆分离结果显示CASC11在结直肠癌细胞中主要位于胞浆,其位置决定了 CASC11的功能可能主要是和调节靶基因稳定性或翻译有关。分别在SW620细胞中干扰和过表达CASC11,然后加入放线菌酮D抑制hnRNP-K的mRNA生成,检测hnRNP-K的稳定性,发现随着CASC11表达降低,hnRNP-K的mRNA降解速度也加快,CASC11表达增加,则hnRNP-K的mRNA降解速度减慢。说明CASC11可以增强hnRNP-K的稳定性。(4)hnRNP-K对CASC11有反作用,二者之间具有相关性在结直肠癌细胞株中干扰或过表达hnRNP-K,做qRT-PCR可以引起CASC11的表达量出现相应的改变,说明hnRNP-K对CASC11是有反作用的。IHC和qRT-PCR结果均显示hnRNP-K在20对结直肠癌组织中表达明显高于周围正常组织。相关性分析结果显示hnRNP-K与CASC11之间呈正相关(r=0.57,P<0.01)。4.CASC11通过hnRNP-K激活WNT通路及下游的靶基因(1)CASC11高表达的结直肠癌组织中信号通路分析GSEA基因富集分析结果显示,在基因芯片GSE8671数据中,WNT通路在CASC11高表达的结直肠癌中表达上调,并且通路相关基因富集(P<0.05)。(2)CASC11可以调节WNT通路活性及下游靶基因的表达TOP和FOP双荧光素酶报告基因结果显示,在结直肠癌细胞SW620中抑制CASC11表达,则TOP/FOP比值减小,说明WNT活性降低(P<0.05);在结直肠癌细胞SW620中过表达CASC11后则TOP/FOP比值增大,说明WNT信号通路活性增高(P<0.05)。IHC和qRT-PCR结果均显示在CASC11干扰后,WNT通路下游靶基因β-catenin,c-Myc,CycinD1和MMP7表达降低;增加CASC11表达量,则WNT通路下游靶基因β-catenin,c-Myc,CycinD1和MMP7表达随之增高。(3)CASC11 通过 hnRNP-K 激活 WNT 通路分别将稳定干扰CASC11的细胞株SW480和SW620及瞬时过表达CASC11的细胞株SW620和RKO进行核浆蛋白分离,检测β-catenin和hnRNP-K的入核情况,发现干扰CASC11后β-catenin和hnRNP-K入核减少,而过表达CASC11可以增加 β-catenin和hnRNP-K进入细胞核。我们又检测了 hnRNP-K在其中的作用,在CASC11干扰细胞株中过表达hnRNP-K,发现β-catenin和hnRNP-K入核也随之hnRNP-K表达量的恢复而增多;在过表达CASC11的细胞株中干扰hnRNP-K,则发现β-catenin和hnRNP-K的入核也随着hnRNP-K的减少而减少,说明了 CASC11是通过hnRNP-K来起作用。(4)CASC11通过hnRNP-K激活WNT通路的可能机制应用蛋白质免疫共沉淀COIP技术,我们检测了 hnRNP-K和WNT通路相关蛋白的结合情况,发现hnRNP-K可以和WNT通路的β-catenin,AXIN2,GSK3β TCF4相结合。在WNT通路中,AXIN2和GSK3β有对β-catenin的降解作用,hnRNP-K能和AXIN2和GSK3β结合说明hnRNP-K可能在保护β-catenin不被降解中起作用;同时hnRNP-K又能和TCF4结合,TCF4位于核内,说明hnRNP-K可能在β-catenin入核的转运或和TCF4结合中也起了作用。有待进一步实验证实。5.结直肠癌中CASC11的上游调控机制(1)c-Myc作为转录因子可以调控CASC11的表达在TRANSFAC网站生物信息学分析结果显示CASC11启动子区域有c-Myc的结合位点,通过双荧光素酶报告基因结果发现在HEK293细胞和SW480细胞中c-Myc能使荧光素酶活性明显增强。CHIP实验结果显示,c-Myc可以直接结合在CASC11启动子的E-box区域(-1274～-1279bp)。通过干扰和过表达c-Myc检测CASC11的表达情况,发现c-Myc能调节CASC11的表达。通过相关性分析发现c-Myc和CASC11在结直肠癌组织中的表达具有相关性。(2)c-Myc能增强CASC11启动子区域乙酰化并进一步促进CASC11表达在UCSC网站数据中发现CASC11启动子区域有明显H3K27AC,CHIP结果证实了CASC11启动子区域有H3K27AC。通过干扰SW620细胞中c-Myc的表达,发现抑制c-Myc之后CASC11启动子E-box区域乙酰化水平也降低。表明c--Myc可以增强CASC11启动子区域乙酰化水平。在SW480和SW620细胞中干扰c-Myc之后,CASC11水平降低,当加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA之后,CASC11水平增加,表明乙酰化在c-Myc调节CASC11表达中有重要作用,乙酰化增强可以促进CASC11的表达。结论1.CASC11在结直肠癌组织中表达增加,且与结直肠癌的大小、浆膜浸润、淋巴结转移和分期相关,在结直肠癌中发挥癌基因的作用。2.干扰CASC11表达抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力;过表达CASC11则促进肿瘤细胞的增殖和迁移。3.hnRNP-K是CASC11的靶基因,CASC11通过增加hnRNP-K的稳定性来促进其表达。hnRNP-K的表达对CASC11具有正反馈作用。4.CASC11通过hnRNP-K激活WNT通路活性。5.c-Myc可以促进CASC11启动子区域乙酰化并进一步上调CASC11的表达。