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背景创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI),具有高致死致残的特点,给众多家庭以及社会造成了巨大的负担。TBI病理生理过程包括:原发性损伤和继发性损伤;继发性损伤是TBI重要的病理过程,也是我们在临床可以干预的。关于继发性损伤的理论很多,炎症反应在TBI治疗和预后中起重要的作用。在近年来关于PD-1/PD-L1通路的研究越来越多,PD-1/PD-L1信号通路作为重要的免疫调控通路,可以调节巨噬细胞和淋巴细胞等细胞的活性及多种细胞因子分泌,在肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病方面研究较多。PD-1/PD-L1信号通路在创伤性疾病的研究较少,目前PD-L1在TBI后脑挫裂伤上相关的炎性细胞上的表达情况仍不清楚,所以我们设计本课题对该问题进行研究。目的实验一:小胶质细胞是中枢神经系统重要的固有免疫细胞,设计犬爆震模型,收集不同时间死亡的犬脑标本,采用免疫荧光染色的方法,探索PD-L1在犬脑爆震伤后小胶质细胞表达情况及规律;实验二:对TBI后不同时间点手术所取人脑挫裂伤标本进行染色,研究TBI后人脑裂伤标本炎症细胞的浸润情况;另外研究PD-L1在TBI后人脑挫裂伤标本中小胶质细胞、星型胶质细胞及神经元细胞的表达情况,为进一步通过干预PD-1/PD-L1信号通路提供理论依据。方法实验一:选取成熟雌性实验用比格犬28只,体重8-10kg,23只比格犬建立爆震伤后在死亡后立即取脑组织标本,并放于4%的多聚甲醛溶液中,保存4℃冰箱。依据爆震到死亡的时间进行划分,实验组可分为30min组7例、2h组6例、5h组5例、2d组5例,另外设置正常对照组5例。标本用4%多聚甲醛固定,然后进行25%蔗糖溶液脱水,制作冰冻切片,之后进行PD-L1-Iba-1双标免疫荧光染色,将切片放于荧光显微镜下观察,每张切片挑选4个不同的视野进行照相留图,用Image Pro Plus6.0软件统计分析不同时间点小胶质细胞表达PD-L1的情况。实验二:收集2014-2015年期间解放军第一五三医院神经外科行手术治疗的创伤性脑损伤患者的挫裂伤标本。共收集人脑挫裂伤标本15例(6 h组5例、12 h组4例、1 d组3例、4 d组3例)和正常对照脑组织7例。标本用4%多聚甲醛固定,然后进行25%蔗糖溶液脱水,制作冰冻切片,首先进行H-E染色,在普通显微镜下观察采图用Image Pro Plus6.0软件统计各时间点标本浸润炎症细胞情况;另外分别行PD-L1与小胶质细胞标志物Iba-1或神经元标志物Neun或星形胶质细胞标志物GFAP免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察采图,统计分析人脑挫裂伤后小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元表达PD-L1的情况。所有标本的收集和用途获得解放军第一五三医院伦理委员会的同意,并获得患者家属同意并签字。结果实验一:表达PD-L1的小胶质细胞的阳性细胞数于震后5h组有所升高(28±3.16)(P<0.01),并在2d组明显增加(40±4.28)(P<0.05);实验二:1.对H-E染色切片中浸润炎性细胞数进行统计,结果发现:脑挫裂伤后6 h(P=0.7908)内及12 h(P=0.8397),未见到明显的炎症细胞浸润;随着损伤时间的延长,浸润的来自血液中的炎症细胞明显增加:1d组(8.25±1.50)(P<0.01);4d组(9±0.82)(P<0.01)。2.在人脑挫裂伤后,小胶质细胞在脑挫裂伤后明显活化,对PD-L1抗体、Iba-1抗体和Hoechst33342三者都为阳性染色的细胞进行计数。结果发现:表达PD-L1的小胶质细胞阳性细胞数于脑挫裂伤后6h组明显升高(38±6.56)(P<0.01),挫裂伤后12 h组(60.8±5.46)表达高于6 h组(P<0.05);挫裂伤后1 d组与12 h相比无明显增加(P>0.05);而挫裂伤后4 d(101±14.60)组比损伤1 d组明显增加(P<0.05)。3.脑挫裂伤后,神经元以及星形胶质细胞也可以表达PD-L1。结论1.人脑挫裂伤后炎症反应参与了继发性损伤。2.PD-1/PD-L1信号通路参与了继发性损伤的炎症反应,对PD-1/PD-L1通路的干预可能成为治疗脑损伤后炎症反应的新方法。