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巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)具有中等强度的致病性,是集约化养鸡场最常见的球虫之一。寻找有效的保护性抗原有助于研制第三代抗球虫疫苗。本研究构建了巨型艾美耳球虫孢子化卵囊的cDNA表达文库,经过四轮免疫筛选,筛选出6个免疫保护效果较好的阳性克隆基因,并选择了其中一个进行克隆表达。具体进行了以下工作:1.利用Gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库利用Gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库。首先,从新鲜采集的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA并分离纯化mRNA,用CloneMinerTMⅡcDNA文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库。再将cDNA重组到表达载体pVAX1.0上,从而构建了巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库。之后,用7种已知巨型艾美耳球虫基因的引物对文库进行验证。结果显示,构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库总容量为0.92× 107cfu,插入片段平均大小约为1.63kb,表达文库总容量为2.32×107cfu,插入片段平均大小约为1.64kb,二者的重组率都为100%,能用特异性引物扩增出7种已知的巨型艾美耳球虫基因。表明该文库质量高,代表性强,为进一步筛选免疫保护性抗原基因奠定了坚实基础。2.巨型艾美耳球虫cDNA表达文库免疫筛选本部分利用表达文库免疫法对巨型艾美耳球虫cDNA表达文库进行了四轮免疫筛选。每轮筛选提取质粒,14日龄,实验组腿部肌肉注射文库质粒,pVAX1.0空质粒免疫感染对照组注射pVAX1.0空质粒,免疫剂量100μg/羽,非免疫非感染对照组和非免疫感染对照组注射PBS,21日龄加强免疫。28日龄,除非免疫非感染组外,其余组分别经口感染新鲜的E.maxima孢子化卵囊1.5×105个/羽。7天后剖杀所有鸡,对增重、克粪便卵囊数、肠道病变记分这些指标进行统计,然后综合计算每组的抗球虫指数(ACI),评价其免疫保护效果。ACI≥160的判定为阳性克隆组,之后进行连续分割直到筛选出免疫保护性抗原基因,推导出各个基因的最大ORF,翻译成氦基酸序列后进行BLASTP同源性分析。结果表明,EmHP-1编码氨基酸序列与巨型艾美耳球虫一保守的 hypothetical protein(GenBank:CDJ56976.1)的相似性达 82%,EmSAG编码氨基酸序列与巨型艾美耳球虫的SAG family member(GenBank:CD J60815.1)的相似性为100%,EmRP编码氨基酸序列与巨型艾美耳球虫的rhomboid family domain-containing protein,putative(GenBank:CDJ59262.1)相似性为 84%,EmHP-2编码氨基酸序列与巨型艾美尔球虫的推测蛋白(GenBank:CDJ61108.1)相似性为70%,EmCKRS编码氨基酸序列与巨型艾美耳球虫一个推定的蛋白cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit(GenBank:CDJ61187.1.)的相似性达 100%,EmJS-1与和缓艾美尔球虫的一假定蛋白selR domain-containing protein相似性达66%,与柔嫩艾美耳球虫的一假定蛋白selR domain-containing protein相似性达69%,与巨型艾美耳球虫的已知基因无相似性。3.EmRP基因的克隆与表达本部分利用PCR技术扩增从巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库中筛选出的阳性克隆EmRP基因。序列分析表明EmRP基因的ORF含774bp,编码257个氦基酸,理论分子量28.2kDa。构建EmRP基因的原核表达质粒pClodTF-EmRP,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得了表达,免疫印迹试验结果显示:表达的重组蛋白能被自然感染巨型艾美耳球虫的鸡血清所识别。