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牛肉大理石纹(Beef Marbling)是沉积于肌束和肌纤维之间的一定量肌内脂肪所呈现的外观表现,即包括肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量和分布,是衡量牛肉质量等级的最关键指标。作为大理石纹的物质基础,IMF直接参与肉质嫩度、风味和多汁性等性能的形成,是影响肉质性状与经济价值的最为重要因素。由于传统肉质选育方法无法进行活体直接测定,选育成本高,进度迟缓,利用DNA标记筛选IMF性能的主效基因成为改进IMF含量和脂肪酸组成、提高肉质性能的有效方法。本实验以日本黑毛和牛为研究对象,采用添加含肥育牛血浆的成脂诱导培养基,检测肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因表达,并结合屠宰实验分析这些基因表达水平与大理石纹等级(Beef Marbling Standard, BMS)、肌肉不饱和度(Unsaturated fatty acids/Saturated fatty acids, US/S)的相关性,筛选影响日本黑毛和牛肌内脂肪沉积的候选基因,为进一步探究肌内脂肪沉积的机制,改善肉品品质提供理论依据。主要研究内容如下：1.牛肌内前体脂肪(Bovine intramuscular preadipocyte, BIP)细胞的分离、培养及鉴定采集3头成年育肥日本黑毛黑牛第6-7肋间的肌肉,分离肌内脂肪组织,利用胶原酶消化法分离获得牛肌内前脂肪细胞,体外培养,绘制生长曲线,诱导BIP细胞成脂分化,采用油红O染色法和RT-PCR鉴定诱导所得细胞。结果显示,分离培养的BIP细胞均一性良好,呈梭形,贴壁生长,生长曲线呈“S”形,倍增时间43.3h；经成脂诱导培养8d,油红O染色可见胞内红色脂滴,RT-PCR检测显示,BIP细胞表达GLUT-1,不表达GLUT-4,而诱导所得BIP细胞表达GLUT-1, GLUT-4的表达丰度较低。本实验证明分离培养所得细胞具有BIP细胞形态和基因表达特性,为后续实验奠定基础。2.BIP细胞化过程中成脂基因的表达分析复苏所得的冻存BIP细胞,传代2-3次,利用含5mM辛酸、50ng/mL胰岛素、0.25mM地塞米松和10mM乙酸钠的成脂诱导培养基定向诱导BIP细胞向成熟脂肪细胞分化,收集诱导0、2、4、6、8d细胞,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中成脂基因的表达。结果显示,转录因子PPAR-γ和C/EBP-δ在诱导2d明显大幅上调,其中,PPAR-γ于2d达到表达高峰,4d明显回落,随后维持稳定略有升高趋势；C/EBP-δ表达于4d达到最高水平,6d显著下调,之后稳定略有升高。然而,SREBP-1表达水平呈一种基本稳定略有下降趋势,正常培养和成脂诱导培养的细胞内SREBP-1表达无显著差异。脂肪合成相关酶基因FASN和SCD表达水平随诱导培养呈”上升-下降-上升”趋势,于8d出现最高表达。脂肪酸转运相关基因aP2和CD36表达水平在分化前中期相似,即在诱导2d迅速表达,达到表达峰值,4d明显下调；在分化中后期,aP2表达逐渐升高,8d达到最高水平,而CD36维持稳定略有升高趋势。脂肪酸转运基因之一的FATP1处于相对稳定略有下调状态。本实验结果表明,在分化早期以转录因子的转录激活为主,而中后期脂肪酸合成和跨膜转运更活跃。此外,上述基因的表达模式可能存在种属差异和细胞系差异。3.BIP细胞分化过程中成脂基因的表达水平与IMF性能的相关性分析选取源于日本东北部4个区域的47头日本黑毛和牛,分别饲喂正常饲料和添加膨软米的饲料,于肥育期(22月龄)采集血液样本,制备血浆,用于配制47个诱导培养基。复苏所得的冻存BIP细胞,传代2-3次,利用含2.5%肥育牛血浆和7.5%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的成脂诱导培养基,分别定向诱导BIP细胞向成熟脂肪细胞分化,收集诱导8d细胞,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中成脂基因的表达。屠宰达到上市期(27-31月龄)的47头实验用牛,采集最长肌,按照日本牛肉质量分级标准评定BMS,同时检测肌内脂肪酸组成,分析与诱导后BIP细胞内成脂基因的相关性。结果表明：屠宰时BMS分别与aP2(R=0.469)、SREBP-1(R=0.389)和PPAR-y(R=0.533)的表达水平之间存在正相关,差异极显著(P<0.01)。屠宰时最长肌的US/S与SREBP-1表达量(R=0.398)呈现正相关,差异极显著(P<0.01)。基于肥育牛血浆来源进一步分析,使用饲喂正常饲料的牛血浆,BMS与PPAR-y表达(R=0.428)呈明显正相关(P<0.05),最长肌的US/S与SREBP-1表达(R=0.600)呈正相关,差异极显著(P<0.01)；使用饲喂膨软米的牛血浆,BMS分别与aP2(R=0.646, P<0.01)、 SREBP-1(R=0.459, P<0.05)和PPAR-y(R=0.621, P＜0.01)表达呈正相关,最长肌的US/S与4个基因表达量之间未见相关性。这说明PPAR-y在标记肌内脂肪含量方面更为可靠,SREBP-1在指示脂肪酸成分方面具有较高的稳定性。