拟南芥AtLrgB基因的进化分析与功能研究

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细菌的IrgA/B和cidA/B操纵子编码胞壁质水解酶调控因子,在细菌的自我分解机制中起重要作用.拟南芥基因组中有一个细菌IrgB基因的同源基因,称之为AtLrgB。通过序列比对发现,拟南芥基因组中许多编码肽聚糖合成酶的基因是缺失的,因此拟南芥细胞中没有肽聚糖结构。同时,拟南芥中不存在编码胞壁质水解酶的基因,因此,AtLrgB基因在进化过程中功能发生了改变。本研究通过对AtLrgB突变体和过量表达体的表型观察和分析,阐述了AtLrgB基因在拟南芥生长发育中的功能。得到的主要结果如下:   1.构建了AtLrgB-EGFP融合蛋白来分析AtLrgB蛋白的亚细胞定位.结果表明,AtLrgB蛋白位于叶绿体内膜上,同时,构建了PAtLrgB:GUS启动子报告株系。GUS的组织化学染色结果表明AtLrgB基因主要在拟南芥的地上部分表达,在根中不表达.并且,GUS的表达主要集中在幼嫩的组织中,在成熟叶片中其表达从叶尖到叶片基部逐渐消失,表明AtLrgB基因的启动子受到的调控类似于叶片从库到源转交的调控机制.对于AtLrgB基因在一个光周期内表达量的实时定量PCR检测结果表明,AtLrgB基因的表达受到昼夜节律的调控.   2.T-DNA插入突变体αtlrgB-1植株与AtLrgB-RNAi转基因植株都表现出浅绿的子叶和幼叶.当atlrgB-1突变体在培养基上生长到8天时,子叶的叶尖开始出现坏死,并且逐渐扩散,然后第一对真叶也出现坏死。将PAtLrgB:AtLrgB转入突变体中进行表型弥补实验,结果证明突变体的表型与AtLrgB基因的T-DNA插入直接相关.   3.通过构建35S:AtLrgB表达载体,获得了AtLrgB过量表达的拟南芥转基因纯系。通过表型观察,发现AtLrgB基因的过量表达导致了植株叶片萎黄和生长迟缓。   4.观察了野生型、atlrgB-1突变体和过量表达体叶片的叶绿体亚显微结构。突变体和过量表达体的叶肉细胞中,叶绿体的类囊体结构都表现出稀疏的现象.atlrgB-1突变体叶绿体中的淀粉粒比野生型中大,并且数量更多;而在过量表达体中,淀粉粒很少甚至消失.维管束鞘细胞中,atlrgB-I突变体的叶绿体基本正常,而过量表达体的叶绿体较小,并且类囊体结构很少。   5.测定了野生型、atlrgB-1突变体和过量表达体叶片的淀粉含量。结果表明突变体在白天比野生型累积了更多的淀粉,而过量表达体的淀粉累积量很少.同时,还测定了三种植株中蔗糖的含量。白天,突变体叶片中的蔗糖含量始终低于野生型;夜晚,突变体蔗糖含量先发生了短暂的急剧增加,然后逐渐减少.对于过量表达体来说,白天叶片中的蔗糖含量基本与野生型相等,只是在光周期的最后阶段略高于野生型;夜晚时分叶片中的蔗糖含量始终低于野生型。   6.研究了培养基中不同蔗糖浓度对于atlrgB-1突变体和AtLrgB基因过量表达体表型的影响。在2%蔗糖浓度培养基上生长的atlrgB-1突变体植株相较于1%蔗糖浓度培养基上生长的植株,其叶片坏死出现得迟,并且坏死区域较少.而过量表达体在2%蔗糖浓度培养基上生长时,表现出更严重的萎黄表型,同时,还发现外源的葡萄糖对于突变体与过量表达体的影响类似于蔗糖。这些结果说明突变体和过量表达体的异常表型与破水化合物的可获得性是密切相关的.   7、经序列查找和比对,发现AtLrgB的同源蛋白在细菌和植物中是广泛存在的.这些同源蛋白的LrgB结构域氨基酸序列比对结果表明,这一结构域在细菌和植物中是高度保守的.同时,将植物中同源基因的N端序列与原核生物的LrgA结构域进行了氨基酸序列的比对后发现,这些基因的N末端与原核生物的LrgA结构域具有相似性,尽管这种相似性比LrgB结构域低.比对结果表明,从原核生物到真核生物的进化过程中,LrgA和LrgB基因发生了基因融合。   8.构建了35S:AtLrgB-D1和35S:AtLrgB-D2过量表达体,表型观察结果表明,单个LrgA结构域与LrgB结构域过量表达体都表现出35S:AtLrgB过量表达体的萎黄表型,同时,构建了PAtLrgB:AtLrgB-D1和PAtLrgB:AtLrgB-D2表达载体来对突变体进行表型弥补实验.在突变体内回转入PAtLrgB AtLrgB-D1和PAtLrgB:AtLrgB-D2都不能弥补突变体的表型,说明行使AtLrgB功能需要完整蛋白的存在。因此,原核生物的LrgA和LrgB很有可能进化为拟南芥AtLrgB蛋白的两个功能结构域.
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