基于表面增强拉曼光谱分析技术的真菌检测鉴别研究

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真菌在自然环境和人造环境中无处不在,它们对人类活动和健康具有巨大而深远的影响,其中有害真菌会对公众和经济健康构成重大威胁。临床上真菌感染已成为常见的感染性疾病之一,死亡率高达30%~60%。所以对真菌的检测鉴别方法研究受到广泛关注。表面增强拉曼散射(SERS)能够产生高于拉曼效应10~6~1012倍的增强信号,达到单分子检测所需的灵敏度。SERS技术因其具有快速、步骤简单、成本低、结果准确且样本损失较小等优点,近年来在生物医学领域中致病菌检测方面逐渐展现出巨大的应用潜力。本文研究工作及结果如下:(1)PDMS/Ag SERS基底的制备及真菌的SERS鉴别。通过化学自组装法将纳米银溶胶颗粒组装到PDMS表面,得到了PDMS/Ag SERS基底。基底具有较好的均一性和重复性,以罗丹明6G(R6G)为探针分子,对基底的SESR效能进行了测试,研究结果表示PDMS/Ag基底能检测到10-7 M的R6G溶液,其表观增强因子为3.88×10~4。在该基底上对白色念珠菌和烟曲霉进行了SERS测试,实验结果显示,在400~710 cm-1范围的拉曼信号被PDMS的拉曼峰掩盖而未能探测到有效信号,其仅能探测到白色念珠菌/烟曲霉在710~1700 cm-1范围的部分特征信号。针对收集的SERS谱图,实验采用主成分分析和线性判别结合(PCA-LDA)的分类模型,对白色念珠菌和烟曲霉进行了分类,PCA-LDA模型对于这两种真菌的分类正确率为97.5%,盲样测试正确率为90%。(2)Au NCs@Ni foam基底的制备及真菌的SERS检测。利用Au3+/Au(0.99V)的电极电位大于Ni2+/Ni(-0.25V)的电极电位,Ni与Au3+发生化学置换反应,通过调控CTAB的浓度和反应时间,使金在三维镍泡沫上生长形成独特的纳米锥结构作为SERS基底;通过优化发现,在20 mg/m L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)存在下反应6 h获得的Au NCs@Ni foam基底具有较高的检测灵敏度,对R6G的检测极限达到10-8 M,表现增强因子为3.01×10~6,并且具有良好的均一性和重现性。进而在Au NCA@Ni foam纳米复合SERS基底上进行了白色念珠菌和烟曲霉SERS测试,通过图谱分析发现,发现白色念珠菌和烟曲霉在400?1700 cm-1波长范围内存在不同的拉曼信号峰,这些拉曼光谱信号主要体现为核酸、磷脂、蛋白质、碳水化合物和多糖的典型振动带的信息。针对收集的SERS谱图,实验采用PCA-LDA分类模型,对白色念珠菌和烟曲霉进行了分类,其分类正确率及盲样测试正确率都为100%。(3)基于SERS标签对白色念珠菌的定量检测。白色念珠菌是真菌感染中最常见的条件性真菌,它引起的念珠菌血症具有较高的死亡率,对白色念珠菌的高灵敏检测对临床诊断具有重要的意义。实验采用两步计时电流沉积技术制备了具有优异均一性和检测重现性的ITO-Ag纳米复合基底,通过Ag-S共价键将含巯基和羧基的11-巯基十一烷酸(MUA)分子链接在基底上,进行羧基功能化修饰,然后通过氨基与羧基间的共价键将白色念珠菌抗体固定在ITO-Ag基底上形成“ITO@nano-Ag-COOH-antibody”纳米复合SERS基底,用于白色念珠菌的捕获;采用Lee and Meisel法制备了纳米银溶胶,以纳米Ag颗粒作为增强介质,制备了抗体功能化的SERS标签(Ag@4-MBA@Antibody);通过形成Ag@4-MBA@Antibody标签/白色念珠菌/ITO@nano-Ag-COOH-antibody的“三明治”夹心复合物结构,对白色念珠菌进行定量检测。在浓度为10~10~6 CFU/L范围内,白色念珠菌浓度与表面增强拉曼散射信号强度呈良好的线性关系,对白色念珠菌的实际最低检出限为10 CFU/m L。本测试方法为白色念珠菌的定量检测提供了一种普适性的高效测试新途径。
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