论文部分内容阅读
大白猪和梅山猪的生长发育、瘦肉率低和肉品质差异很大，其机制有待深入研究。本研究旨在探究大白猪和梅山猪生前肌纤维发育的差异以及母体能量水平对其调控作用，同时阐明以上过程肌肉中miRNAs的表达规律，为深入研究肌纤维发育的分子机制提供参考。试验选用初产大白母猪（135.54±3.27kg）和梅山母猪（71.8±2.75kg）各40头，每个品种按照背膘和体重一致原则随机分成2组，饲喂不同能量水平的试验日粮，即大白3400cal/kg、3000cal/kg和梅山3000cal/kg、2600cal/kg4个处理组，每个处理4重复，每个重复5头猪，试验期120d。分别于妊娠35d、55d、90d采取胎儿骨骼肌，测定胎儿肌纤维直径与密度、肌纤维类型组成，并通过高通量测序检测妊娠35d大白猪和梅山猪背肌中miRNAs表达谱差异，验证测序结果，同时检测miR-1、miR-133、miR-206在各处理组的表达规律。试验结果如下: (1)肌纤维随时间点的发育规律在大白猪和梅山猪上是相同的，妊娠前期(E35d～E55d)肌纤维的发育主要是初级肌纤维直径的增加和周围结缔组织的生长，而妊娠后期(E55d～E90d)肌纤维的发育主要是次级肌纤维的剧烈增殖和生长。妊娠90d才可以通过ATPase染色法区分快肌和慢肌，比目鱼肌中Ⅰ型肌纤维比例高达35.78％，胫骨前肌、趾长伸肌和半腱肌中Ⅱb型肌纤维相对比例均超过40％，确定前者为慢肌、后者为快肌用于后续试验。 (2)推荐最适营养水平下（大白3400 cal/kg、梅山2600cal/kg）大白猪妊娠90d的肌纤维密度显著高于梅山猪(P＜0.05)，相同营养水平下（大白3000 cal/kg、梅山3000cal/kg）梅山猪妊娠35d和55d的肌纤维密度显著高于大白猪(P＜0.05)，妊娠90d的肌纤维密度有高于大白猪的趋势。3000cal/kg饲粮显著降低了大白猪妊娠55d肌纤维密度(P＜0.05);3000cal/kg饲粮有增加梅山猪肌纤维密度的趋势，且显著增加了肌纤维直径。 (2)大白猪和梅山猪妊娠35d胎儿背最长肌miRNA表达谱存在差异。通过miRNAs高通量测序分别得到4.09M和4.64M的高质量读段，小RNAs长度分布在21-23nt之间;鉴定出1147个unique miRNAs（特异性无重复序列的miRNAs），其中猪已知的miRNAs434个，猪保守的miRNAs239个，猪候选的miRNAs个474个，测序读段中三者所占比例分别为92.83％、5.66％、1.50％。Unique miRNAs里表达量排名前30的miRNAs占到所有读段比例的70.41％，预测得到10182个靶基因，GO和KEGG分析显示:这些靶基因的功能显著富集(P＜0.05)在调控肌肉的氨基酸代谢、脂肪酸代谢、骨形成、细胞器功能、生物酶活的维持、转录调控等生物学过程。梅山猪和大白猪有213个差异表达的miRNAs(P＜0.05)，表达量排名前50的miRNAs占到所有读段的比例为94.51％，分别预测到差异上调（14个）和差异下调（36个）miRNAs的靶基因4846和12159个，GO和KEGG分析显示:这些靶基因的功能显著富集(P＜0.05)在调控细胞的脂质代谢、氨基酸代谢、半乳糖代谢、钙离子信号、mTOR信号、肌肉收缩、细胞增殖等生物学过程。梅山猪和大白猪各自3个生物学重复的样品间miRNAs表达水平相关系数均大于0.95，且随机选择差异表达的9个miRNAs经过RT-qPCR验证，表达趋势与测序结果一致。 (4)随妊娠时间35d、55d、90d推移，miR-133的表达水平显著增加（P＜0.05）;miR-1和miR-206的表达先显著增加(P＜0.05)，再显著降低（P＜0.05）。推荐最适营养水平下（大白3400 cal/kg、梅山2600cal/kg），大白猪妊娠35d和妊娠55d的miR-133和miR-206、妊娠90d的miR-1和miR-206表达均显著高于梅山猪(P＜0.05)。相同营养水平下（大白3000 cal/kg、梅山3000cal/kg），整个妊娠期间梅山猪miR-133的表达水平始终高于大白猪（P＜0.05），miR-1和miR-206在两个品种间没有明显的表达规律。3000cal/kg的饲粮显著下调了大白猪妊娠55d的miR-133、miR-1和miR-206的表达（P＜0.05），显著上调了梅山猪妊娠35d和90d的miR-133、miR-1、miR-206表达(P＜0.05)。半腱肌、胫骨前肌、趾长伸肌中miR-133、miR-1和miR-206的表达量均显著高于比目鱼肌(P＜0.05)。 综上所述，本研究得到以下结论:梅山猪和大白猪肌纤维随时间点的发育规律是一致的，但是相同营养水平下梅山猪的生肌能力更强，可能是调控脂质代谢、氨基酸代谢、半乳糖代谢、mTOR信号通路的miRNA表达存在差异。低能不利于大白猪肌纤维发育，高能促进了梅山猪肌纤维发育，可能是影响了生肌关键miRNA的表达。快肌中生肌关键miRNA的表达高于慢肌。