论文部分内容阅读
肿瘤细胞的耐药和多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是导致化疗失败的一个重要因素,严重影响了临床化疗的效果。导致多药耐药发展的原因很多,其中 ABC 转运蛋白家族即 ATP 结合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter,ABC)对化疗药具有转运作用,这可能是导致多药耐药性发生和发展的重要因素。ATP结合盒式转运体B亚家族成员1(ABCB1)是ABC转运蛋白家族的重要成员,具有药物转运功能,是肿瘤多药耐药产生的重要原因。因此,寻找到可以抑制ABCB1蛋白且高效低毒的化合物就可以逆转ABCB1为底物的化疗药的多药耐药。因而寻找具有选择性的ABCB1抑制剂成为研究的关键。本课题探讨了化合物WS-10对耐药肿瘤细胞多药耐药性的逆转能力,并对化合物WS-10逆转耐药的机制进行研究。具体研究内容如下: 1. MTT法检测化合物 WS-10对结肠癌细胞、肺癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞等多种癌症细胞系的细胞毒性。化合物WS-10在浓度为20μM时,对细胞增殖抑制率均小于20%,认为化合物对以上几种细胞系没有细胞毒性。 2. 用结肠癌细胞SW620与其耐药细胞系SW620/Ad300作为基础,用MTT法筛选化合物WS-10在无毒浓度下,对临床常用药紫杉醇、阿霉素和顺铂产生的耐药逆转作用。其中,紫杉醇和阿霉素为 ABCB1 为底物的化疗药;而化疗药顺铂不是ABCB1蛋白的底物,可作为对照。结果表明,化合物WS-10可以逆转 ABCB1 为底物的化疗药紫杉醇和阿霉素的耐药作用,而化合物WS-10对于非ABCB1底物的化疗药顺铂没有逆转耐药效果。 3. 使用工具细胞HEK293T和慢病毒感染技术我们建立了ABCB1蛋白高表达的细胞株 HEK293T/ABCB1。使用建立的细胞株 HEK293T/ABCB1 重复以上MTT实验。实验结果与SW620及SW620/Ad300的实验结果相同,这进一步证明了化合物WS-10是通过影响蛋白ABCB1实现逆转耐药的作用。 4. 显微镜观察耐药细胞SW620/Ad300在加入紫杉醇、化合物WS-10后的形态学变化,发现细胞加入紫杉醇或紫杉醇、化合物WS-10同时加入后,形态发生变化,从排列整齐、大小规则的多边形转变成排列无序、大小不一的圆形;而单独加入化合物WS-10前后细胞形态学没有发生明显变化。 5. 利用超高性能液相色谱(UPLC)检测亲本细胞 SW620 及其耐药细胞SW620/Ad300在与无毒浓度的化合物WS-10孵育72h或不与化合物孵育后,加入相同浓度紫杉醇孵育相同时间时,细胞内紫杉醇的蓄积。经过化合物WS-10 孵育的耐药细胞内紫杉醇的蓄积量明显高于没有化合物 WS-10 孵育的耐药细胞。这证明WS-10可以影响ABCB1的功能使细胞内紫杉醇蓄积量增加,从而达到逆转耐药的效果。 6. 利用流式细胞仪检测化合物WS-10对耐药细胞内药物外排的影响。结果表明化合物WS-10能降低ABCB1高表达细胞中化疗药物的外排的效果。这说明化合物可能通过影响 ABCB1的功能,减少细胞内化疗药外排,实现逆转耐药。 7. 通过Western blot技术检测,得到不同浓度不同作用时间的化合物WS-10都没有显著改变 ABCB1 蛋白的表达水平。通过q-PCR技术检测,得到化合物WS-10没有改变ABCB1的mRNA的表达水平。说明化合物WS-10逆转耐药的效果不是通过改变ABCB1表达水平而实现的。 8. 通过免疫荧光技术,检测蛋白 ABCB1的细胞定位。用不同浓度的化合物WS-10与亲本细胞SW620及其耐药细胞SW620/Ad300在细胞培养箱中孵育72h后检测。实验结果表明,化合物WS-10不影响ABCB1的细胞定位。 9. 细胞热转移试验 (CETSA)是验证药物靶向与蛋白结合的方法。将化合物WS-10 孵育过与未孵育的ABCB1 蛋白置于不同温度下相同时间后,用western blot检测蛋白的量。实验结果表明,化合物WS-10能与蛋白ABCB1结合。从另一方面说明化合物 WS-10 可以作用于 ABCB1 而发挥逆转耐药的作用。 本研究课题发现了嘧啶并三氮唑类化合物WS-10为选择性ABCB1抑制剂,其在无毒浓度下可逆转转运蛋白ABCB1介导的肿瘤细胞耐药。在此基础上我们进行化合物WS-10逆转耐药机制的研究,结果表明,WS-10是通过抑制ABCB1转运泵的外排转运功能实现逆转耐药,而不影响ABCB1的蛋白表达。进一步研究发现,化合物 WS-10 能与 ABCB1 蛋白结合,增加细胞内化疗药物的累积,从而使耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性提高,发挥逆转耐药的效果。研究结果显示,化合物 WS-10 可能为治疗 ABCB1 蛋白高表达的耐药肿瘤打开新的突破口,为解决肿瘤多药耐药提供新的治疗策略。