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摘要：目的：开发高灵敏度、高特异性的血清多肽标志物及其检测技术,联合检测多种多肽类标志物,对肿瘤等重大疾病的早期筛查均具有非常重要的意义。Pep4及相关肽(Pep9、Pep15)是前期筛选出的肿瘤候选血清多肽标志物,对该标志物的检测方法和应用价值尚未进行深入研究。本论文旨在建立检测候选血清多肽标志物Pep4及相关肽(Pep9、Pep15)的ELISA方法,初步评价该标志物在不同类型临床肿瘤样本中的表达水平及实际应用价值,并进一步探讨多标志物联合检测对提高肿瘤诊断效率的促进作用。方法：本论文采用碳二亚胺法分别制备了Pep、Pep9及Pep15的偶联抗原,通过动物免疫制备鼠源单克隆抗体。所制备的抗体分别进行亲和层析法纯化、过碘酸钠氧化法标记HRP酶。考察不同多肽抗原与抗体反应的最佳条件,建立合适的ELSIA方法并进行方法学考察。将所建立的ELISA方法应用到6种肿瘤血清样本的(共计192例)检测,采用Medcalc分析软件对Pep4及相关肽在不同肿瘤中的表达水平进行初步统计评价。结果：获得3株(2B7、7D8、5A7)抗Pep4的杂交瘤细胞株,纯化抗体的效价分别为1：320000、1：160000、1：160000。获得2株(2B7、3D11)可抗Pep9、Pepl5的杂交瘤细胞株,其中纯化后的3D11对Pep9、Pep15的效价分别为1：2000、1：4000。纯化后的抗体经HRP酶标记处理,效价无明显影响。对3种ELISA方法(夹心法、直接法、间接法)的血清检测结果进行比对,确定间接ELISA法更适合于检测血清中的Pep4,其中抗体2B7稀释度1：20000,线性范围80-1000ng/mL(r=0.9946),该法可区分6种肿瘤与正常样本,且各肿瘤组问差异显著(P<0.05),对肝癌和乳腺癌的检测敏感性和特异性均>90%。建立“蛋白-多肽组合式”双抗体夹心ELISA法检测Pep9和Pep15。抗体IgG-HKa包被量为100nng／孔,标记抗体"HRP-IgG-相关肽”1：1000稀释后检测,本方法的线性范围6-120ng/mL(r=0.9997),最低检测限1.7ng/mL。该法能显著区分肿瘤组与正常组,且在部分肿瘤组间存在差异,对肠癌的检测灵敏度及特异性最高。对比分析pep4和Pep9、Pep15的检测结果,发现该类标志物对食管癌的诊断具有较高一致性(Kappa=0.55);两组标志物联合检测的结果与临床诊断结果具有较高一致性(Kappa>0.6),其中对乳腺癌的联合诊断效果最好(Kappa=0.83)。结论：多肽Pep4及相关肽的杂交瘤细胞株特异性好、抗体活性高,为本文的ELISA方法建立和标志物联合检测提供了合格与充足的免疫学研究原材料。针对不同的多肽标志物,建立了多种ELISA方法,其中间接ELISA法适用于pep4的检测,而“蛋白-多肽组合式”双抗夹心ELSIA适用于相关肽的检测,并实现了多标志物联合检测。通过不同肿瘤样本和正常样本的检测,验证了多肽Pep4及相关肽在肿瘤诊断中的实际应用价值,可作为多种肿瘤辅助诊断的标志物。本文利用方法一致性分析也证实了Pep4及相关肽在肿瘤诊断中具有很好的诊断互补作用。文中含图24幅,