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目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy DN)是糖尿病最常见的微血管并发症。以糖尿病肾病为原发病的终末期肾衰发病率逐年上升。在我国,每年花费大量的人力、物力、财力维持这些病人的治疗。然而糖尿病肾病的发病机制仍不清楚,临床上治疗糖尿病肾病有待于新的突破。目前,虽然对于DN的发病机制仍不清楚,但是大量研究证实氧化应激在DN的发病机制中发挥了非常重要的作用。糖尿病的机体处于氧化应激状态,促进了脏器实质细胞的损害和凋亡的发生。ROS的产生与高糖诱导肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)凋亡密切相关。而FOXO1(Forkhead Box,FOX)是PI3K/AKT信号通路中关键的转录调节因子。在氧化应激环境中,PI3K/AKT信号通路会促使FOXO1发生去磷酸化作用并增加其结合下游因子DNA的能力,从而定位于细胞核,增强其转录活性。FOXO1与氧化应激及氧化应激引起的细胞凋亡等密切相关。然而,到目前为止,有关FOXO1与系膜细胞凋亡的具体关系以及相关作用机制还未见报道。在本项目中我们拟通过体外培养细胞,采用FOXO1小干扰RNA上调FOXO1表达,观察SIRT1/FOXO1与肾脏系膜细胞凋亡的关系。为了研究在慢性肾脏疾病中肾脏实质细胞凋亡的分子机制。我们进一步检测了凋亡相关蛋白和部分凋亡相关信号通路。为慢性肾脏疾病的治疗提供新思路。方法:构建FOXO1的si RNA干扰质粒,使用Lipofectamine 2000转染试剂将FOXO1 si RNA质粒和对照质粒分别转染MMCs,G418筛选稳定的MMCs细胞系。以正常糖浓度(NG)培养的MMCs为对照,以HG刺激MMCs。TUNEL法检测凋亡细胞数目,Western blot法检测细胞内SIRT1、FOXO1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、SOD1、SOD2、P47,NOX4、β-actin蛋白的表达。RT-PCR检测细胞FOXO1、Bax、Bcl-2的m RNA的表达。结果:1高糖对FOXO1表达的影响实验结果显示,与NG组相比,HG组FOXO1的表达明显减少。FOXO1si RNA质粒转染能明显上调高糖诱导的FOXO1表达情况。证实FOXO1si RNA对MMC的FOXO1上调效果明显。2敲低FOXO1表达明显抑制高糖诱导的MMC凋亡。TUNEL结果显示,与NG组相比,HG组MMC凋亡明显增多,与HG组和载体对照组相比,FOXO1 si RNA转染能够显著抑制HG诱导的MMC凋亡。表明FOXO1与高糖诱导的MMC凋亡密切相关。3敲低FOXO1表达下调高糖诱导的Bax/Bcl-2比值。Western blot及RT-PCR实验结果显示,与NG组相比,HG组Bax/Bcl-2m RNA水平和蛋白表达比率显著增加。与HG组和载体对照组相比,FOXO1 si RNA转染明显降低Bax/Bcl-2 m RNA和蛋白的比率。表明FOXO1与高糖诱导的MMC凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达情况密切相关。4敲低FOXO1表达抑制高糖诱导cleaved Caspase-3表达Western blot及RT-PCR实验结果显示,与NG组相比,HG组活化的cleaved Caspase-3蛋白表达明显提高。FOXO1 si RNA转染后,HG组高糖诱导的cleaved Caspase-3的高表达明显被抑制。证实,FOXO1的活化与高糖诱导的MMC凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3表达情况密切相关。5敲低FOXO1表达对高糖诱导过氧化物酶激活的影响Western blot结果显示,与NG组相比,HG组过氧化物酶SOD1,SOD2蛋白表达水平明显降低,P47及NOX4蛋白表达明显增多。与HG组相比,转染FOXO1 si RNA质粒能够明显上调高糖抑制的氧化物酶表达,抑制P47及NOX4蛋白表达情况。6上调SIRT1表达对高糖诱导的FOXO1的影响Western blot结果显示,与NG组相比,HG组FOXO1蛋白表达水平明显降低。与HG组相比,转染SIRT1激活剂能够明显上调高糖诱导的FOXO1表达情况。说明SIRT1能够影响高糖条件下FOXO1的活化,从而调控高糖诱导的系膜细胞凋亡。结论:1上调FOXO1表达能够减少HG诱导的细胞凋亡及Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3的表达。2上调FOXO1表达能够上调HG抑制的氧化物酶SOD1,SOD2,上调P47及NOX4蛋白表达。3上调SIRT1能够影响高糖条件下FOXO1的活化,从而调控高糖诱导的系膜细胞凋亡。