背景:糖尿病患者约30%可合并糖尿病肾病(DN),缓慢进展引起尿毒症;在欧美、日本等发达国家,糖尿病肾病已经是慢性肾病(CKD)及尿毒症的最主要病因。所以探索糖尿病肾病的发病机制,为治疗糖尿病肾病提供新靶点具有重要意义。近年来研究发现,肾小球脏层上皮细胞,即足细胞(podocyte)在糖尿病肾病蛋白尿产生及发展过程中起重要作用,因此,保护足细胞免受损伤是阻断DN发生和进展的关键所在。但目前对导致足细胞损伤的确切细胞内信号机制尚不清楚。而且,目前治疗糖尿病肾病的手段还很有限,更缺乏保护足细胞、减少其凋亡的有效治疗药物。自噬是细胞对多种应激的适应性反应,能够降解受损的细胞器和蛋白质,从而维持细胞内环境的稳定。自噬对肾脏有保护作用,正常情况下,体内肾脏足细胞保持高水平的基础自噬,而糖尿病肾病时足细胞自噬活性下降。白藜芦醇(Resveratrol),化学名为芪三酚(3’,5’,4’-trihydroxystibene),属于非黄酮类多酚化合物,具有清除自由基、抗炎症、抗肿瘤等多种药理作用。在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠、db/db小鼠的研究中白藜芦醇干预能减轻蛋白尿、改善肾功能,但白藜芦醇作用的靶点和作用的机制均未完全明确。截止目前,白藜芦醇对糖尿病肾病蛋白尿形成的关键机制足细胞凋亡的影响、白藜芦醇如何影响高糖状态下足细胞凋亡的作用机制,如调控足细胞自噬及信号机制等目前均未见报道。本研究观察白藜芦醇是否能够通过激活足细胞自噬,减少高糖状态下足细胞凋亡,降低糖尿病小鼠蛋白尿产生,延缓糖尿病肾病的进展。研究目的:白藜芦醇通过自噬减轻db/db小鼠肾脏足细胞凋亡,降低蛋白尿产生,延缓糖尿病肾病进展。研究方法:第一部分:白藜芦醇改善dbd/db小鼠肾功能,降低蛋白尿产生。8周龄的雌性小鼠共18只,其中C57BL/KsJ db/db小鼠12只,C57BL/KsJ db/m小鼠6只,适应性喂养1周后开始实验。将12只db/db小鼠随机分为模型组、白藜芦醇治疗组,每组6只;6只db/m小鼠为正常对照组。治疗组小鼠采用白藜芦醇10mg/(kg·d)的剂量灌胃,连续给药12周。给药结束后,处死三组小鼠,称体重、肾重,用代谢笼收集24h尿标本检测尿微量白蛋白量,采血检测血糖、尿素氮和肌酐,血压检测。第二部分:白藜芦醇对db/db小鼠足细胞自噬和凋亡的影响;1.体内动物模型观察肾小球足细胞自噬和凋亡:db/m小鼠为正常对照组、db/db小鼠、db/db小鼠+白藜芦醇治疗组三组观察就12周结束后,留取肾组织,透射电镜观察小鼠足细胞自噬变化,免疫组化和免疫荧光法检测小鼠肾脏足细胞标记蛋白synaptopodin、自噬标记蛋白LC3Ⅱ变化。留取肾组织行HE、PAS染色,透射电镜观察肾脏足细胞和基底膜的改变,免疫组化和免疫荧光法法检测小鼠肾脏足细胞标记蛋白nephrin和synaptopodin、凋亡蛋白cleavedcaspase-3蛋白的表达水平的变化。2.体外细胞培养观察足细胞自噬和凋亡:体外培养人足细胞,37℃C分化成熟后不同糖浓度(5.6、11.1、20、30 mmol/L)刺激 24h,western blot 检测Cleavedcaspase-3、Bax 的表达变化。30 mmol/L 高糖干预 0、6、12、24、36、48 h,western blot 检测 Cleavedcaspase-3、Bax、Atg5、P62 和 LC3-Ⅱ 的表达情况,明确高糖对体外培养的足细胞自噬和凋亡的影响。(2)白藜芦醇(0、5、10、15μmol/L)和高糖(30 mmol/L)共同刺激足细胞48h,western blot检测上述蛋白的表达情况。分对照组、高糖组(30mmol/L)、高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)组、高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)+巴伐洛霉素 A1(bafilomycin A,10nM)组干预足细胞 48h,运用 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率,透射电镜观察自噬体的形成变化,细胞免疫荧光技术检测Cleaved caspase-3、Atg5、P62和LC3-Ⅱ的表达情况。体外培养人足细胞,转染GFP-LC3后分为对照组、高糖组(30 mmol/L)、高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)组,高糖(30mmol/L)加白藜芦醇(15 μmol/L)+巴伐洛霉素A1(bafilomycin A,10nM)组刺激48h后应用荧光显微镜观察GFP-LC3蛋白荧光的变化,明确白藜芦醇对高糖状态下体外培养的足细胞自噬和凋亡的影响。第三部分:白藜芦醇可能通过增加足细胞自噬通路,降低高糖诱导足细胞凋亡。体外培养人足细胞,3-MA预刺激2h后分组予以高糖及白藜芦醇干预,western blot检测LC3Ⅱ、Cleaved caspase-3、Bax蛋白的表达变化。足细胞转染Atg5 shRNA后予以高糖和白藜芦醇干预,western blot技术检测上述蛋白的表达变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率,透射电镜观察自噬体的变化,明确抑制足细胞自噬后白藜芦醇干预及高糖状态下足细胞凋亡的影响。结果:第一部分:(1)db/db模型组和白藜芦醇治疗组小鼠初始体重无差异,白藜芦醇治疗后有下降趋势但仍高于正常组;db/db模型组和白藜芦醇治疗组小鼠肾重/体重指数无显著差异。(2)db/db模型组和白藜芦醇治疗组小鼠血糖和血压水平无显著差异,但较正常组小鼠有明显升高;与正常组小鼠相比,db/db小鼠血尿素氮和肌酐、24小时尿微量白蛋白水平均明显升高,白藜芦醇治疗后较模型组有明显下降。第二部分:白藜芦醇对db/db小鼠足细胞自噬和凋亡的影响;(1)与正常组小鼠相比,db/db小鼠肾小球组织足细胞nephrin表达量明显减少,白藜芦醇治疗后肾小球足细胞nephrind蛋白的表达量较前增加。(2)与正常组小鼠相比,db/db小鼠肾小球足细胞LC3 Ⅱ、synaptopodin蛋白表达明显减少,cleaved caspase-3蛋白表达增多;白藜芦醇治疗后,LC3Ⅱ、synaptopodin蛋白表达增加,cleaved caspase-3蛋白表达减少。(3)与正常组小鼠相比,肾脏HE和PAS染色结果示db/db模型组小鼠肾小球肥大,毛细血管基底膜增厚,系膜区增宽,经过白藜芦醇治疗后病变程度减轻。(4)与正常组小鼠相比,透射电镜示db/db模型组小鼠肾小球基底膜增厚,足细胞数量减少,足突增宽、融合,白藜芦醇治疗组与模型组比较足突病变减轻。(5)高糖处理足细胞36h,Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达有所下降,至48h出现明显下降,但是P62蛋白增加。加入白藜芦醇后Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达上调,P62蛋白表达降低,自噬小体数量增多,GFP-LC3绿色荧光颗粒数目增多,LC3-Ⅱ蛋白(红色荧光)的阳性表达升高。高糖组同时加入白藜芦醇和巴伐洛霉素A1时候,自噬流受阻,P62增加,Atg5和LC3-Ⅱ蛋白的表达上调。(6)高糖刺激足细胞后Cleaved caspase-3和Bax的表达呈现浓度和时间依赖性增高,加入白藜芦醇后Cleaved caspase-3和Bax的表达降低,细胞凋亡率下降,Cleaved caspase-3蛋白(红色荧光)减少。第三部分:白藜芦醇降低高糖诱导足细胞凋亡的部分机制通过增加足细胞自噬通路。3-MA抑制自噬后LC3-Ⅱ蛋白表达下降,p62增加,Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达增高。转染Atg5 shRNA后LC3-Ⅱ蛋白表达下降,Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达增高,自噬体数目明显减少,早期凋亡率增加。提示足细胞自噬增加是白藜芦醇降低高糖诱导足细胞凋亡的机制之一。结论:第一部分:白藜芦醇改善db/db小鼠肾脏肾功能,降低蛋白尿,延缓糖尿病肾病进展;第二部分:在高糖培养的足细胞中,我们实验观察到自噬体逐渐增加,到24小时高峰,随后48小时降低;而在db/db小鼠肾脏模型中,自噬一直是降低的;白藜芦醇干预后增加db/db小鼠肾脏足细胞自噬,降低高糖诱导足细胞凋亡。第三部分:分析了白藜芦醇可以通过增加足细胞自噬,降低足细胞凋亡,明确了足细胞自噬增加是白藜芦醇降低高糖诱导足细胞凋亡的机制之一。