论文部分内容阅读
本研究采用抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)技术构建了低温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺差减cDNA文库，通过斑点杂交、EST测序、RQ-PCR等手段对差减结果进行验证并对正库中丰度最高的四跨膜蛋白基因进行了克隆与鉴定。研究结果如下: 1.低温肋迫下凡纳滨对虾肝胰腺差减cDNA文库构建及差异ESTs分析 构建了以低温处理和常温对虾肝胰腺cDNA差减文库各1个，分别为正库和负库。斑点杂交实验结果表明，正、负文库768个克隆呈高表达的克隆分别为152个、331个，即前者为低温高表达，后者为常温高表达克隆。正文库100个克隆测序后拼接获得ESTs同源群39个，已知基因29个;负文库50个克隆拼接获得ESTs同源群18个，已知基因17个。 2.部分基因的低温诱导差异表达验证 采用RQ-PCR法对对差减获得的耐寒相关功能基因进行验证。实验结果显示，挑选的四个基因(TSPAN8、HSPB1、NGT4和NGT7)在18℃低温胁迫时均呈显著上调表达，验证了这四个基因是低温诱导差异表达基因。NGT7、HSPB1和TSPAN8的表达峰值在15℃，NGT4表达峰值在13℃。温度降至11℃时，这四个基因表达量均有所下降，但仍显著高于常温表达量。 进一步对正文库中丰度最高的TSPAN8基因在常温组和低温处理组(13℃)对虾不同组织的差异表达进行评估，发现LvTSPAN8基因在低温处理组对虾(13℃)心脏、鳃和肝胰腺组织中呈低温上调表达;在肌肉中呈低温下调表达。 3.LvTSPAN8基因克隆及生物信息学分析 LvTSPAN8基因含有一个720bp的开放阅读框(ORF)，共编码239个氨基酸，预测Lv TSPAN8基因相对分子质量大小为25.61KDa。通过Blast进行同源比对发现，凡纳滨对虾中分离的四跨膜蛋白与之前报道的中国明对虾（Fenneropenaeus Chinensis）四跨膜蛋白TSPAN8、青蟹（Scylla paramamosain）四跨膜蛋白TSPAN8和CD53相似性分别为83.7％、52.7％和48.5％，并通过多序列比对发现四跨膜超家族中存在22个保守的氨基酸序列，暗示该家族基因在功能上的保守性。不同物种四跨膜蛋白的系统发育树分析显示，凡纳滨对虾TSPAN8和F.chinensis TSPAN8属于相同的进化枝，经TMHMM软件预测，LvTSPAN8蛋白有一个保守的四跨跨膜区，N-端和C-端位于细胞膜内，保守的CCG序列和半胱氨酸残基出现在TSPAN的外环区域。