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1、体外实验
ZMYL方大鼠含药血清对顺铂耐药卵巢癌细胞C0C1/DDP生长的影响
研究目的:
(1)观察ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞生长的影响。
(2)观察ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞的顺铂敏感性的影响。
(3)观察ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞周期和凋亡率的影响。
研究方法:
(1)采用ZMYL颗粒混悬液制备大鼠含药血清。
(2)应用MTT比色法观察不同浓度的中药血清(4.82g/Kg、9.64g/Kg、19.28g/Kg)和顺铂(3μg/ml)对C0C1/DDP细胞生长的影响,分别计算不同时间点(48h、72h、96h)的细胞增殖抑制率。
(3)采用MTT比色法检测中药组(4.82g/Kg)、顺铂组(3μg/ml)、联合组(中药血清+顺铂)作用不同时间(48h、72h、96h)的C0C1/DDP细胞增殖抑制率。
(4)采用流式细胞仪(FCM)PI法测定空白对照血清组、中药各剂量血清组、顺铂组(3μg/ml)、联合组(中药血清+顺铂)作用于细胞48h后,各组细胞周期的变化。
(5)AnnexinV/PI法检测空白对照血清组、中药各剂量血清组、顺铂组(3μg/ml)、联合组(中药血清+顺铂)作用于细胞48h后,各组细胞的凋亡率。
研究结果:
(1)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞生长的影响:中药高、中、低剂量组血清作用于C0C1/DDP细胞48h、72h、96h后,与空白对照组比较,吸光度值逐渐下降(P<0.05),以96h尤为明显;顺铂组与之比较,吸光度值略有下降,但无统计学差异(P>0.05);中药高、中、低剂量组细胞增殖抑制率较顺铂组明显升高(P<0.01);并且随着作用时间的延长,抑制率逐渐升高,以96h作用最为显著;组间比较,以高剂量组作用最为显著(P<0.01)。
(2)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞的顺铂敏感性的影响:测定48h、72h、96h的细胞增殖抑制率,联合组的增殖抑制率最高,较中药组和单纯顺铂组明显升高(P<0.01);中药组的增殖抑制率高于顺铂组(P<0.01);随着作用时间的延长,各组的细胞增殖抑制率均逐渐升高,以96h作用最为显著。
(3)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞凋亡的影响:中药高、中、低剂量组与空白对照组比较,细胞凋亡率均明显增加(P<0.01);与顺铂组比较,细胞凋亡率亦明显增加(P<0.01);联合组细胞凋亡率最高,与其他各组比较,均有极显著性差异(P<0.01)。
(4)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞周期的影响:中药高、中、低剂量组与空白对照组比较,G0-G1期细胞比例减小,G2-M期细胞比例增加(P<0.01);中药高剂量组与空白对照组比较,S期细胞比例减小(P<0.01),中药中、低剂量组与之比较,S期则无明显差异(P>0.05);联合组与顺铂组比较,G0-G1、S期细胞比例进一步减小,G2-M期细胞比例明显增加,有极显著性差异(P<0.01)。
研究结论:
(1)ZMYL方大鼠含药血清有一定的抑制C0C1/DDP细胞增殖的作用,并可阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。
(2)ZMYL方大鼠含药血清能改善耐药细胞株C0C1/DDP对顺铂的敏感性,从而改善化疗耐药。
2、体内实验
ZMYL方改善裸鼠卵巢癌顺铂耐药性的实验研究及其机制探讨
研究目的:
(1)建立顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察ZMYL方对化疗后荷瘤裸鼠一般生存状况和生存时间的影响。
(2)观察ZMYL方对顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。
(3)观察ZMYL方对顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤细胞周期和凋亡率的影响。
(4)观察ZMYL方对细胞凋亡调控基因、“药泵”耐药机制相关基因以及缺氧因子表达的影响。
研究方法:
(1)以顺铂耐药卵巢癌细胞株C0C1/DDP构建耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。
(2)造模成功后,将裸鼠随机分为六组,分别是空白对照组,中药高、中、低剂量组,顺铂治疗组,联合治疗组,分别给予ZMYL颗粒混悬液灌胃,顺铂溶液腹腔注射。每三天测量瘤体最大径线和最小径线,计算肿瘤体积。连续给药三周,给药结束后处死部分裸鼠测取指标,剩余裸鼠观察一个月计算生存期延长率。
(3)通过检测肿瘤体积及瘤体重量,绘制肿瘤生长曲线和计算抑瘤率。
(4)剥取新鲜瘤体,切成不同大小组织块,部分用于流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;部分用0.25g/L戊二醛固定,备透射电镜观察细胞超微结构;部分用10%甲醛固定,用于石蜡包埋、切片,备免疫组化;部分放于Trizol液中,备RT-PCR。
(5)剥取裸鼠肺、肝组织放置于10%甲醛固定,石蜡包埋、切片,HE染色镜检,观察病理变化。
(6)采用RT-PCR法检测肿瘤组织凋亡调控基因(Bax、Bcl-2、P53)和“药泵”耐药机制相关基因(MDR1、P-gp、LRP)mRNA的表达。
(7)采用免疫组化法检测肿瘤组织凋亡调控基因(Bax、Bcl-2、P53)、“药泵”耐药机制相关基因(MDR1、P-gp、LRP)和缺氧标记物(HIF-1α、Glut1)蛋白的表达。
研究结果:
(1)ZMYL方对化疗后裸鼠一般生存状况和生存时间的影响:中药各剂量组裸鼠一般状况较好,中药联合化疗组裸鼠生存状况优于顺铂化疗组;空白对照组平均生存天数19.0±2.55天,各药物治疗组与之比较,生存天数均明显增加,有显著性差异(P<0.05);中药各剂量组均能延长裸鼠存活时间,联合治疗组存活时间最长,但各药物治疗组间比较无差异(P>0.05);比较生存期延长率,联合治疗组最高,为43.16±6.86%,较其他各组明显升高,有显著性差异(P<0.05)。
(2)ZMYL方对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用观察:各组裸鼠瘤体重量比较:各药物治疗组与空白对照组比较,瘤重均明显减小,有极显著性差异(P<0.01);联合治疗组抑瘤率最高,与其他各组比较,有极显著性差异(P<0.01)。中药各剂量组抑瘤率低于顺铂组(P<0.01),以高剂量组抑瘤率最高,组间比较差异显著(P<0.01)。
(3)ZMYL方对卵巢癌裸鼠移植瘤细胞凋亡率的影响:各药物治疗组与空白对照组比较,细胞凋亡率均明显增加(P<0.01);联合治疗组细胞凋亡率明显高于顺铂治疗组(P<0.01);中药高剂量组凋亡率高于顺铂组,中、低剂量组低于顺铂组,有显著性差异(P<0.05)。
(4)ZMYL方对卵巢癌裸鼠移植瘤细胞周期的影响:中药高、中、低剂量组与空白对照组比较,G0-G1期细胞比例明显减少,G2-M期细胞比例明显增加,有显著性差异(P<0.01);中药高、中剂量组S期细胞比例较空白对照组减少,低剂量组较之增加(P<0.01);联合治疗组与顺铂治疗组比较,G0-G1期、S期细胞比例明显减少,G2-M期细胞比例明显增加,有显著性差异(P<0.01)。
(5)ZMYL方对凋亡调控基因表达的影响:RT-PCR显示:中药高、中、低剂量组可明显下调mtP53的表达,与空白对照组比较,有显著性差异(P<0.01);中药高、中剂量组Bax的表达较对照组升高(P<0.01),Bcl-2的表达较对照组降低(P<0.01);低剂量组与之比较,则无差异(P>0.05)。免疫组化显示:中药高、中、低剂量组可明显上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2的表达,与空白对照组比较,有显著性差异(P<0.01);中药高、中剂量组mtP53蛋白的表达较空白对照组降低(P<0.01),低剂量组与之比较,则无差异(P>0.05)。RT-PCR及免疫组化均显示:联合组与顺铂组比较,可明显上调Bax的表达,下调Bcl-2、mtP53的表达。
(6)ZMYL方对“药泵”耐药机制相关基因表达的影响:RT-PCR显示:中药高、中、低剂量组MDR1的表达较对照组略有下降(P>0.05),P-gp的表达较对照组明显下降(P<0.01),中药高剂量组LRP较对照组明显下降(P<0.01),中、低剂量组无显著差异(P>0.05);联合组与顺铂组比较,MDR1、P-gp、LRP的表达均明显降低(P<0.01)。免疫组化显示:中药高剂量组MDR1、P-gp、LRP蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.01);中药中剂量组P-gp、LRP蛋白表达较对照组降低(P<0.01);中药低剂量组LRP蛋白表达较对照组降低(P<0.01);联合组与顺铂组比较,MDR1、P-gp、LRP蛋白的表达均明显降低(P<0.01)。
(7)ZMYL方对缺氧标记物蛋白表达的影响:免疫组化显示:中药高剂量组HIF-1α、Glut1蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.01),中剂量组HIF-1α的表达低于对照组(P<0.01),而低剂量组HIF-1α、Glut1的表达与对照组比较,无显著差异(P>0.05);联合组与顺铂组比较,HIF-1α、Glut1的表达均明显降低(P<0.01)。
研究结论:
(1)ZMYL方可以改善化疗后裸鼠生存状况,延长裸鼠生存时间。
(2)ZMYL方具有一定的抑制顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用。
(3)ZMYL方具有一定的诱导顺铂耐药卵巢癌裸鼠瘤体细胞凋亡的作用,并可影响细胞周期。
(4)ZMYL方具有调节凋亡相关基因、“药泵”耐药机制相关基因以及缺氧因子的表达的作用。
(5)ZMYL方辅助化疗可以增强耐药卵巢癌裸鼠对顺铂的敏感性,改善化疗耐药。