1、体外实验　　 ZMYL方大鼠含药血清对顺铂耐药卵巢癌细胞C0C1/DDP生长的影响　　 研究目的：　　 (1)观察ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞生长的影响。　　 (2)观察ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞的顺铂敏感性的影响。　　 (3)观察ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞周期和凋亡率的影响。　　 研究方法：　　 (1)采用ZMYL颗粒混悬液制备大鼠含药血清。　　 (2)应用MTT比色法观察不同浓度的中药血清(4.82g／Kg、9.64g／Kg、19.28g／Kg)和顺铂(3μg／ml)对C0C1/DDP细胞生长的影响，分别计算不同时间点(48h、72h、96h)的细胞增殖抑制率。　　 (3)采用MTT比色法检测中药组(4.82g／Kg)、顺铂组(3μg／ml)、联合组(中药血清+顺铂)作用不同时间(48h、72h、96h)的C0C1/DDP细胞增殖抑制率。　　 (4)采用流式细胞仪(FCM)PI法测定空白对照血清组、中药各剂量血清组、顺铂组(3μg／ml)、联合组(中药血清+顺铂)作用于细胞48h后，各组细胞周期的变化。　　 (5)AnnexinV/PI法检测空白对照血清组、中药各剂量血清组、顺铂组(3μg/ml)、联合组(中药血清+顺铂)作用于细胞48h后，各组细胞的凋亡率。　　 研究结果：　　 (1)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞生长的影响：中药高、中、低剂量组血清作用于C0C1/DDP细胞48h、72h、96h后，与空白对照组比较，吸光度值逐渐下降(P＜0.05)，以96h尤为明显；顺铂组与之比较，吸光度值略有下降，但无统计学差异(P＞0.05)；中药高、中、低剂量组细胞增殖抑制率较顺铂组明显升高(P＜0.01)；并且随着作用时间的延长，抑制率逐渐升高，以96h作用最为显著；组间比较，以高剂量组作用最为显著(P＜0.01)。　　 (2)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞的顺铂敏感性的影响：测定48h、72h、96h的细胞增殖抑制率，联合组的增殖抑制率最高，较中药组和单纯顺铂组明显升高(P＜0.01);中药组的增殖抑制率高于顺铂组(P＜0.01)；随着作用时间的延长，各组的细胞增殖抑制率均逐渐升高，以96h作用最为显著。　　 (3)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞凋亡的影响：中药高、中、低剂量组与空白对照组比较，细胞凋亡率均明显增加(P＜0.01)；与顺铂组比较，细胞凋亡率亦明显增加(P＜0.01)；联合组细胞凋亡率最高，与其他各组比较，均有极显著性差异(P＜0.01)。　　 (4)ZMYL方大鼠含药血清对C0C1/DDP细胞周期的影响：中药高、中、低剂量组与空白对照组比较，G0-G1期细胞比例减小，G2-M期细胞比例增加(P＜0.01)；中药高剂量组与空白对照组比较，S期细胞比例减小(P＜0.01)，中药中、低剂量组与之比较，S期则无明显差异(P＞0.05)；联合组与顺铂组比较，G0-G1、S期细胞比例进一步减小，G2-M期细胞比例明显增加，有极显著性差异(P＜0.01)。　　 研究结论：　　 (1)ZMYL方大鼠含药血清有一定的抑制C0C1/DDP细胞增殖的作用，并可阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。　　 (2)ZMYL方大鼠含药血清能改善耐药细胞株C0C1/DDP对顺铂的敏感性，从而改善化疗耐药。　　 2、体内实验　　 ZMYL方改善裸鼠卵巢癌顺铂耐药性的实验研究及其机制探讨　　 研究目的：　　 (1)建立顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察ZMYL方对化疗后荷瘤裸鼠一般生存状况和生存时间的影响。　　 (2)观察ZMYL方对顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。　　 (3)观察ZMYL方对顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤细胞周期和凋亡率的影响。　　 (4)观察ZMYL方对细胞凋亡调控基因、“药泵”耐药机制相关基因以及缺氧因子表达的影响。　　 研究方法：　　 (1)以顺铂耐药卵巢癌细胞株C0C1/DDP构建耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。　　 (2)造模成功后，将裸鼠随机分为六组，分别是空白对照组，中药高、中、低剂量组，顺铂治疗组，联合治疗组，分别给予ZMYL颗粒混悬液灌胃，顺铂溶液腹腔注射。每三天测量瘤体最大径线和最小径线，计算肿瘤体积。连续给药三周，给药结束后处死部分裸鼠测取指标，剩余裸鼠观察一个月计算生存期延长率。　　 (3)通过检测肿瘤体积及瘤体重量，绘制肿瘤生长曲线和计算抑瘤率。　　 (4)剥取新鲜瘤体，切成不同大小组织块，部分用于流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；部分用0.25g／L戊二醛固定，备透射电镜观察细胞超微结构；部分用10％甲醛固定，用于石蜡包埋、切片，备免疫组化；部分放于Trizol液中，备RT-PCR。　　 (5)剥取裸鼠肺、肝组织放置于10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色镜检，观察病理变化。　　 (6)采用RT-PCR法检测肿瘤组织凋亡调控基因(Bax、Bcl-2、P53)和“药泵”耐药机制相关基因(MDR1、P-gp、LRP)mRNA的表达。　　 (7)采用免疫组化法检测肿瘤组织凋亡调控基因(Bax、Bcl-2、P53)、“药泵”耐药机制相关基因(MDR1、P-gp、LRP)和缺氧标记物(HIF-1α、Glut1)蛋白的表达。　　 研究结果：　　 (1)ZMYL方对化疗后裸鼠一般生存状况和生存时间的影响：中药各剂量组裸鼠一般状况较好，中药联合化疗组裸鼠生存状况优于顺铂化疗组；空白对照组平均生存天数19.0±2.55天，各药物治疗组与之比较，生存天数均明显增加，有显著性差异(P＜0.05)；中药各剂量组均能延长裸鼠存活时间，联合治疗组存活时间最长，但各药物治疗组间比较无差异(P＞0.05)；比较生存期延长率，联合治疗组最高，为43.16±6.86%，较其他各组明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。　　 (2)ZMYL方对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用观察：各组裸鼠瘤体重量比较：各药物治疗组与空白对照组比较，瘤重均明显减小，有极显著性差异(P＜0.01)；联合治疗组抑瘤率最高，与其他各组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。中药各剂量组抑瘤率低于顺铂组(P＜0.01)，以高剂量组抑瘤率最高，组间比较差异显著(P＜0.01)。　　 (3)ZMYL方对卵巢癌裸鼠移植瘤细胞凋亡率的影响：各药物治疗组与空白对照组比较，细胞凋亡率均明显增加(P＜0.01)；联合治疗组细胞凋亡率明显高于顺铂治疗组(P＜0.01)；中药高剂量组凋亡率高于顺铂组，中、低剂量组低于顺铂组，有显著性差异(P＜0.05)。　　 (4)ZMYL方对卵巢癌裸鼠移植瘤细胞周期的影响：中药高、中、低剂量组与空白对照组比较，G0-G1期细胞比例明显减少，G2-M期细胞比例明显增加，有显著性差异(P＜0.01)；中药高、中剂量组S期细胞比例较空白对照组减少，低剂量组较之增加(P＜0.01)；联合治疗组与顺铂治疗组比较，G0-G1期、S期细胞比例明显减少，G2-M期细胞比例明显增加，有显著性差异(P＜0.01)。　　 (5)ZMYL方对凋亡调控基因表达的影响：RT-PCR显示：中药高、中、低剂量组可明显下调mtP53的表达，与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)；中药高、中剂量组Bax的表达较对照组升高(P＜0.01)，Bcl-2的表达较对照组降低(P＜0.01)；低剂量组与之比较，则无差异(P＞0.05)。免疫组化显示：中药高、中、低剂量组可明显上调Bax蛋白的表达，下调Bcl-2的表达，与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)；中药高、中剂量组mtP53蛋白的表达较空白对照组降低(P＜0.01)，低剂量组与之比较，则无差异(P＞0.05)。RT-PCR及免疫组化均显示：联合组与顺铂组比较，可明显上调Bax的表达，下调Bcl-2、mtP53的表达。　　 (6)ZMYL方对“药泵”耐药机制相关基因表达的影响：RT-PCR显示：中药高、中、低剂量组MDR1的表达较对照组略有下降(P＞0.05)，P-gp的表达较对照组明显下降(P＜0.01)，中药高剂量组LRP较对照组明显下降(P＜0.01)，中、低剂量组无显著差异(P＞0.05)；联合组与顺铂组比较，MDR1、P-gp、LRP的表达均明显降低(P＜0.01)。免疫组化显示：中药高剂量组MDR1、P-gp、LRP蛋白表达均较对照组明显降低(P＜0.01)；中药中剂量组P-gp、LRP蛋白表达较对照组降低(P＜0.01)；中药低剂量组LRP蛋白表达较对照组降低(P＜0.01)；联合组与顺铂组比较，MDR1、P-gp、LRP蛋白的表达均明显降低(P＜0.01)。　　 (7)ZMYL方对缺氧标记物蛋白表达的影响：免疫组化显示：中药高剂量组HIF-1α、Glut1蛋白表达均较对照组明显降低(P＜0.01)，中剂量组HIF-1α的表达低于对照组(P＜0.01)，而低剂量组HIF-1α、Glut1的表达与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)；联合组与顺铂组比较，HIF-1α、Glut1的表达均明显降低(P＜0.01)。　　 研究结论：　　 (1)ZMYL方可以改善化疗后裸鼠生存状况，延长裸鼠生存时间。　　 (2)ZMYL方具有一定的抑制顺铂耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用。　　 (3)ZMYL方具有一定的诱导顺铂耐药卵巢癌裸鼠瘤体细胞凋亡的作用，并可影响细胞周期。　　 (4)ZMYL方具有调节凋亡相关基因、“药泵”耐药机制相关基因以及缺氧因子的表达的作用。　　 (5)ZMYL方辅助化疗可以增强耐药卵巢癌裸鼠对顺铂的敏感性，改善化疗耐药。