嫩度是牛肉食用品质的最重要指标,由肌原纤维和肌内结缔组织的结构和生化性质所决定。本研究利用蛋白质柱层析技术对牛胰中的组织蛋白酶L进行分离纯化,在研究其酶学性质的同时,利用蛋白质凝胶电泳、透射电镜、相差光学显微镜等手段观察纯化组织蛋白酶L对牛肌原纤维结构及蛋白水解变化,并讨论了该纯化酶对牛肉嫩化的潜在机制,为其宰后成熟嫩化的贡献提供理论依据。具体研究内容和结果如下:对牛胰组织蛋白酶L进行了纯化制备及分子量鉴定。以新鲜牛胰为原料,对组织蛋白酶L进行分离纯化。牛胰匀浆物经酸化粗提,再通过盐析、透析、浓缩、DEAE Sephacel 阴离子交换、SephacrylS-100 分子排阻、SPSepharoseF.F.阳离子交换、Blue Sepharose 6 F.F.染料亲和、ConA Sepharose亲和柱层析等步骤纯化,制备0.58 mg纯酶,纯化倍数达530.54。经SDS凝胶电泳分析,该酶的分子量被鉴定为29.1 kDa。研究了牛胰组织蛋白酶L的酶学性质。经试验结果分析,牛胰组织蛋白酶L的最适反应温度为50℃,活性温度范围为20-50℃,热稳定性随温度升高急剧下降,60 ℃几无活性。最适反应pH为6.5,活性pH范围为4.0～7.5,pH 3.0~8.0处理1h均能保持70%以上活性。巯基还原剂二硫苏糖醇(DTT)、L-半胱氨酸均明显激活了该酶活性,10μmol/L的N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)可完全抑制其活性。1mmol/L的Zn2+对酶活性有明显抑制。该纯化酶可水解苄氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-MCA),其Km值为3.52μmoI/L,Vmax达到500 U/mg;而对苄氧羰基-精氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Arg-Arg-MCA)和L-精氨酰-甲基香豆素(L-Arg-MCA)不表现出水解活性。牛胰组织蛋白酶L能降解多种牛肌原纤维蛋白,可破坏牛肉肌原纤维Z线结构。研究了纯化牛胰组织蛋白酶L对牛背最长肌的肌原纤维的结构和蛋白降解作用。SDS-PAGE显示,该酶可水解肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1、肌动蛋白、肌钙蛋白T、肌钙蛋白Ⅰ、肌钙蛋白C、原肌球蛋白和α-肌动素。通过相差显微镜和透射电镜观察可知,该酶可破坏牛肌原纤维的Z线结构,对A带也产生一定水解作用。这种降解作用与宰后成熟期发生的变化较为一致,因此组织蛋白酶L可能在宰后发挥嫩化作用。