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目的：糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病全身性微小血管病变的肾脏特征性表现，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，也是引起终末肾病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。其基本的病理改变是系膜细胞的增生及细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)成分产生增加。DN发病机制复杂，目前尚未明确，然而，氧化应激和炎症损伤被广泛认为是DN的重要机制，也被我们的前期实验所证实。 氧化应激己被认为是DN发生发展的共同通路。尽管内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)，有保护肾脏的作用。但DM时，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)合成过量的NO与O2-。可迅速发生反应生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-)，导致广泛的氧化应激损伤，参与DN的发病与进展。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)转基因通过减少ONOO-的生成，起到防治DN的作用。我们的前期研究也表明iNOS选择性抑制剂氨基胍和ONOO-清除剂尿酸盐(Urate)可显著延缓DN的发生与进展，提示氧化应激是DN发生的关键。 炎症反应同样在DN的发生发展中起重要作用。作为主要炎症介质的PGE2的合成主要受环氧化酶(cyclooxygenase，COX)的调节。COX-1基因具有调节机体生理平衡，维持内环境稳定的作用。COX-2基因在炎症刺激和其它类型组织损伤时可被诱导，表达明显增加。我们前期的研究表明，COX-2与iNOS共同促进了DN的发生发展。前列环素(Prostacyclin，PGI2)可拮抗PGE2等的致炎效应，而PGI2生成的关键酶前列环素合酶(prostacyclin synthase，PGIS)，在炎症反应中起着重要的平衡作用。 亦有研究表明，内皮功能异常在糖尿病血管病变的发病中也起到关键作用。内皮细胞损伤参与了DN发生发展的全过程。绝大多数内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是由肾小球的血管内皮细胞产生和释放的，在肾脏具有广泛的生物活性。ET是目前所知的最强的长效缩血管活性肽，能产生持续的缩血管效应，在与血管病变有关疾病的发生发展中起着重要作用。ET的活性受内皮素转化酶(endothelin converting enzyme，ECE)调节，DM时ECE活性的上调可导致ET升高。 在DM时，氧化应激、炎症反应、肾素.血管紧张素系统活性增加等共同参与DN的发生发展，他们可通过参与转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)途径的调节，导致ECM积聚及肾小球硬化。TGF-β1主要通过Smad2、Smad3和Smad4蛋白传递信号，启动肾小球基质的主要成份Ⅳ型胶原基因转录。Ⅳ型胶原分子由3条α肽链组成，目前分离得到的单肽链依其一级结构不同，可分为α1(Ⅳ)型胶原链[简写为α1(Ⅳ)]和α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)、α6(Ⅳ)六条。Ⅳ型胶原大分子α链有特定的组织分布。DN时，TGF-β1通路主要经由Smad3激活Ⅳ型胶原基因转录，而Smad3敲除，可使糖尿病小鼠肾皮质Ⅳ型胶原的α1链不表达。 虽然已有研究表明，高糖刺激早期即可引起氧化应激、炎症反应等的损伤性反应，但是在大鼠系膜细胞中，相关酶谱的变化，尚未有报道。而高糖刺激大鼠系膜细胞所引起的早期反应，是否可激活的TGF-β通路，从而导致Ⅳ型胶原的大量生成，尚未有系统研究。 本实验采用高糖培养大鼠肾小球系膜细胞，在不同时间点收集细胞，采用RT-PCR的方法检测早期氧化应激关键酶eNOS、iNOS、SOD，炎症关键酶COX-1、COX-2和PGIS及ECE的表达谱，以探讨高糖刺激早期，相关酶谱的表达变化；RT-PCR检测高糖诱导不同时间点，大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1的表达，同时利用免疫荧光染色法动态观察大鼠肾小球系膜细胞中Smad3的核转位情况，旨在探讨高糖诱导早期反应激活TGF-β/Smads信号通路的情况；RT-PCR检测高糖诱导，大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1下游基因Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各链的表达，旨在探讨在高糖环境下，TGF-β1通路激活Ⅳ型胶原基因各α链的表达情况。 方法： 1培养细胞 传代培养的大鼠肾小球系膜细胞接种于六孔板，10％胎牛血清低糖DMEM培养24小时，细胞换液，无血清DMEM继续培养24小时，使细胞同步化，细胞换液，10％胎牛血清高糖DMEM继续培养。在高糖DMEM培养的不同时间点，终止培养，用于检测。 2总RNA的提取：Trizol法提取细胞总RNA。 3 RT-PCR检测：采用RT-PCR的方法检测氧化应激关键酶eNOS、iNOS、SOD，炎症关键酶COX-1、COX-2、PGIS，ECE、细胞因子TGF-β1及其下游基因Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各链的表达。 4免疫荧光染色法观察Smad3的核转位。 结果： 1氧化应激相关的关键酶iNOS的表达在高糖刺激1小时时明显升高；eNOS表达量无变化；SOD的表达在刺激后明显降低。 2炎症反应相关的关键酶COX-2在高糖刺激0-3小时内呈表达量逐渐升高的趋势；COX-1、PGIS表达量无变化。 3在0-3小时内，ECE mRNA随刺激时间的延长，表达量逐渐增强。 4 TGF-β1的表达具有时间依赖性，3小时开始明显增强，有显著统计学差异。 5 Smad3在高糖刺激80分钟开始有进核迹象，一直持续至180分钟。 6Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链mRNA表达，在6小时时表达量达到高峰，延长至48小时其变化不大；α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)链mRNA无明显表达。 结论： 1高糖刺激大鼠系膜细胞早期(0-3h)，氧化应激关键酶iNOS、炎症反应关键酶COX-2及ECE的表达增加，SOD的表达降低，且均有时间依赖性。 2高糖刺激大鼠系膜细胞，TGF-β1的表达增加，具有时间依赖性；而Smad3的核转位也呈现明显的时间依赖性。 3高糖刺激大鼠系膜细胞，Ⅳ型胶原的α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链表达显著升高，而α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)链不表达，具有表达选择性和时间依赖性。