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目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病全身性微小血管病变的肾脏特征性表现,是糖尿病患者的主要死亡原因之一,也是引起终末肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。其基本的病理改变是系膜细胞的增生及细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)成分产生增加。DN发病机制复杂,目前尚未明确,然而,氧化应激和炎症损伤被广泛认为是DN的重要机制,也被我们的前期实验所证实。 氧化应激己被认为是DN发生发展的共同通路。尽管内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)合成的一氧化氮(nitric oxide,NO),有保护肾脏的作用。但DM时,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)合成过量的NO与O2-。可迅速发生反应生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-),导致广泛的氧化应激损伤,参与DN的发病与进展。而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)转基因通过减少ONOO-的生成,起到防治DN的作用。我们的前期研究也表明iNOS选择性抑制剂氨基胍和ONOO-清除剂尿酸盐(Urate)可显著延缓DN的发生与进展,提示氧化应激是DN发生的关键。 炎症反应同样在DN的发生发展中起重要作用。作为主要炎症介质的PGE2的合成主要受环氧化酶(cyclooxygenase,COX)的调节。COX-1基因具有调节机体生理平衡,维持内环境稳定的作用。COX-2基因在炎症刺激和其它类型组织损伤时可被诱导,表达明显增加。我们前期的研究表明,COX-2与iNOS共同促进了DN的发生发展。前列环素(Prostacyclin,PGI2)可拮抗PGE2等的致炎效应,而PGI2生成的关键酶前列环素合酶(prostacyclin synthase,PGIS),在炎症反应中起着重要的平衡作用。 亦有研究表明,内皮功能异常在糖尿病血管病变的发病中也起到关键作用。内皮细胞损伤参与了DN发生发展的全过程。绝大多数内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是由肾小球的血管内皮细胞产生和释放的,在肾脏具有广泛的生物活性。ET是目前所知的最强的长效缩血管活性肽,能产生持续的缩血管效应,在与血管病变有关疾病的发生发展中起着重要作用。ET的活性受内皮素转化酶(endothelin converting enzyme,ECE)调节,DM时ECE活性的上调可导致ET升高。 在DM时,氧化应激、炎症反应、肾素.血管紧张素系统活性增加等共同参与DN的发生发展,他们可通过参与转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)途径的调节,导致ECM积聚及肾小球硬化。TGF-β1主要通过Smad2、Smad3和Smad4蛋白传递信号,启动肾小球基质的主要成份Ⅳ型胶原基因转录。Ⅳ型胶原分子由3条α肽链组成,目前分离得到的单肽链依其一级结构不同,可分为α1(Ⅳ)型胶原链[简写为α1(Ⅳ)]和α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)、α6(Ⅳ)六条。Ⅳ型胶原大分子α链有特定的组织分布。DN时,TGF-β1通路主要经由Smad3激活Ⅳ型胶原基因转录,而Smad3敲除,可使糖尿病小鼠肾皮质Ⅳ型胶原的α1链不表达。 虽然已有研究表明,高糖刺激早期即可引起氧化应激、炎症反应等的损伤性反应,但是在大鼠系膜细胞中,相关酶谱的变化,尚未有报道。而高糖刺激大鼠系膜细胞所引起的早期反应,是否可激活的TGF-β通路,从而导致Ⅳ型胶原的大量生成,尚未有系统研究。 本实验采用高糖培养大鼠肾小球系膜细胞,在不同时间点收集细胞,采用RT-PCR的方法检测早期氧化应激关键酶eNOS、iNOS、SOD,炎症关键酶COX-1、COX-2和PGIS及ECE的表达谱,以探讨高糖刺激早期,相关酶谱的表达变化;RT-PCR检测高糖诱导不同时间点,大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1的表达,同时利用免疫荧光染色法动态观察大鼠肾小球系膜细胞中Smad3的核转位情况,旨在探讨高糖诱导早期反应激活TGF-β/Smads信号通路的情况;RT-PCR检测高糖诱导,大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1下游基因Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各链的表达,旨在探讨在高糖环境下,TGF-β1通路激活Ⅳ型胶原基因各α链的表达情况。 方法: 1培养细胞 传代培养的大鼠肾小球系膜细胞接种于六孔板,10%胎牛血清低糖DMEM培养24小时,细胞换液,无血清DMEM继续培养24小时,使细胞同步化,细胞换液,10%胎牛血清高糖DMEM继续培养。在高糖DMEM培养的不同时间点,终止培养,用于检测。 2总RNA的提取:Trizol法提取细胞总RNA。 3 RT-PCR检测:采用RT-PCR的方法检测氧化应激关键酶eNOS、iNOS、SOD,炎症关键酶COX-1、COX-2、PGIS,ECE、细胞因子TGF-β1及其下游基因Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)各链的表达。 4免疫荧光染色法观察Smad3的核转位。 结果: 1氧化应激相关的关键酶iNOS的表达在高糖刺激1小时时明显升高;eNOS表达量无变化;SOD的表达在刺激后明显降低。 2炎症反应相关的关键酶COX-2在高糖刺激0-3小时内呈表达量逐渐升高的趋势;COX-1、PGIS表达量无变化。 3在0-3小时内,ECE mRNA随刺激时间的延长,表达量逐渐增强。 4 TGF-β1的表达具有时间依赖性,3小时开始明显增强,有显著统计学差异。 5 Smad3在高糖刺激80分钟开始有进核迹象,一直持续至180分钟。 6Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链mRNA表达,在6小时时表达量达到高峰,延长至48小时其变化不大;α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)链mRNA无明显表达。 结论: 1高糖刺激大鼠系膜细胞早期(0-3h),氧化应激关键酶iNOS、炎症反应关键酶COX-2及ECE的表达增加,SOD的表达降低,且均有时间依赖性。 2高糖刺激大鼠系膜细胞,TGF-β1的表达增加,具有时间依赖性;而Smad3的核转位也呈现明显的时间依赖性。 3高糖刺激大鼠系膜细胞,Ⅳ型胶原的α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α5(Ⅳ)链表达显著升高,而α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)链不表达,具有表达选择性和时间依赖性。