目的和意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤,其发病与爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染、化学促癌物和/或致癌物以及遗传因素密切相关,但迄今为止,鼻咽癌发病的分子机制尚未完全阐明。流行病学研究发现,鼻咽癌的发病具有民族、地域和家族聚集现象,其患者在3号染色体短臂最常发生连续性、非随机性等位基因杂合子缺失(loss of heterozygosity, LOH),其中3p14～21、3p21.3～22和3p25-26是原发性鼻咽癌LOH高频区,且3号染色体短臂的遗传学改变常发生在鼻咽部上皮细胞表型发生异常和EBV感染之前,是鼻咽癌发生过程中的极早期事件。因此,在3号染色体短臂寻找鼻咽癌相关的未知基因对于揭示鼻咽癌癌变早期的分子机制具有重要的意义。MicroRNA (miRNA)是近年来新发现的一类大小约为19～25个核苷酸(nucleotide, nt)的非编码单链小分子RNA,由具有发夹结构的大小约为70～100nt的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶剪切加工后生成,通过与靶基因mRNA的3,非编码区(3’untranslated region,3’UTR)互补匹配导致该mRNA的降解。大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合,通过转录后抑制翻译来调控基因表达。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,而且绝大部分定位于基因间隔区,其转录独立于其他基因,并不翻译成蛋白质,而是在体内代谢过程中发挥多种调控作用,包括动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、胰岛素分泌、脂肪代谢等多种生命活动,其表达失调将导致重大疾病,如肿瘤的发生。正常细胞的生长、增殖、发育、分化和死亡是一个高度有序的过程,而肿瘤的形成正是这一高度有序的过程发生紊乱所造成的,其发生发展是一个多步骤、多阶段、多因素参与的复杂过程,这一过程涉及到多个基因在时间和空间上的协调表达。除了蛋白编码基因,最近研究发现miRNA在肿瘤的发病机制中发挥举足轻重的作用。miRNA作为一类新型基因调控剂,与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明,50%以上的miRNA定位在肿瘤相关的基因组区域,包括LOH区、染色体扩增区及脆性位点等,其表达水平在多种肿瘤中发生改变,通过调控下游靶基因的转录和翻译,影响癌细胞的增殖、分化、凋亡、运动、浸润、转移以及血管生成等生物学特性,发挥癌基因或抑癌基因的作用,多角度多层次的参与了肿瘤的演进。miR-26a首先从Hela细胞克隆得到,全长22nt,在多种组织泛表达,其表达无组织特异性。值得注意的是,miR-26a定位在3p22,此区域恰好为鼻咽癌LOH高频区,也是克隆鼻咽癌候选抑癌基因的关键位点。miR-26a的基因组定位引起了我们的强烈兴趣和极大关注。目前研究发现,miR-26a的表达失调参与了抵御病原微生物入侵的天然免疫应答、器官组织的发育分化以及多种实体瘤和造血系统恶性肿瘤的发病机制等各种生物学过程。而令人费解的是,miR-26a在不同肿瘤的发病机制中扮演了截然相反的双重角色。在淋巴瘤、乳腺癌以及肝癌中,miR-26a在癌组织中表达降低,并发挥抑癌基因的作用；而在胶质瘤中,miR-26a却表达增高,扮演癌基因的角色。然而,迄今为止,鼻咽癌中关于miR-26a功能的相关研究却鲜有报道。那么,鼻咽癌患者3p发生LOH是否引起miR-26a的表达失调, miR-26a的表达失调在鼻咽癌的发生发展中又扮演着何种角色及其分子机理等一系列问题都值得我们深入探讨。基于miR-26a的研究现状及其在鼻咽癌癌变早期分子机制中的潜在意义,本课题的研究目的为明确miR-26a在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性,探讨miR-26a对鼻咽癌细胞生物学特性的影响及其在鼻咽癌发病机制中所发挥的重要作用,阐明miR-26a在鼻咽癌中发挥生物学功能的分子机理,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。材料和方法1.细胞培养人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和HNE-1采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的RPMI 1640培养基,NP69采用KMSF培养基,293T细胞采用DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验。2.临床标本收集18例鼻咽癌组织和16例鼻咽慢性炎组织均来源于南方医院耳鼻喉科标本库,所有标本均为鼻咽部活检组织,经病理学检查确诊,鼻咽癌组织学分型为非角化性未分化型鳞癌,所有患者均尚未接受放化疗治疗。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3.载体构建[1]慢病毒载体pLVTHM/miR-26a:该载体经慢病毒包装、感染细胞后可稳定过表达miR-26a,由本人在南方医科大学肿瘤研究所攻读硕士学位期间构建成功。[2] pGL3-EZH2 wt 3’UTR和pGL3-EZH2 mut 3’UTR:以正常人外周血基因组DNA为模板,扩增EZH2 3’UTR (264bp),将该片段克隆到pGL3-control vector,得到重组质粒pGL3-EZH2 wt3’UTR,然后将该重组质粒进行定点突变,得到突变质粒pGL3-EZH2 mut3’UTR。[3] Lenti-EZH2和Lenti-shEZH2:该慢病毒表达载体可分别过表达和稳定干扰EZH2,由香港中文大学医学院陈杨超教授惠赠。4.慢病毒包装、浓缩及滴度测定采用磷酸钙沉淀法,将慢病毒表达载体(穿梭载体)和慢病毒包装载体(psPAX2和pMD2.G)共转染293T细胞,培养48～72h后收集病毒上清,超速离心进行浓缩纯化,倍比稀释进行滴度测定。5.细胞转染[1] miRNA瞬时转染：采用阳离子脂质体法进行瞬时转染,操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。6孔板中miRNA的转染量为100nM。[2]慢病毒感染：将慢病毒悬液按照不同的病毒感染复数感染鼻咽癌细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光(green fluorescent protein, GFP)发光情况。鉴于慢病毒感染效率较高,以GFP为标记,利用流式细胞仪进行细胞分选获得GFP阳性细胞,分别建立过表达miR-26a、过表达EZH2、稳定干扰EZH2的鼻咽癌细胞株。[3] miRNA与质粒共转染：操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。24孔板中miRNA的转染量为50nM,重组质粒pGL3-EZH2 wt3’UTR和pGL3-EZH2 mut 3’UTR的转染量为100ng,内对照pRL-SV40质粒的转染量为5ng。6.荧光定量PCR抽提细胞和组织的总RNA和小分子RNA,逆转录成cDNA后,采用sybrgreen法进行PCR扩增,通过相对定量以2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度。7. Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10% SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。8.双荧光素酶活性检测将荧光素酶报告基因载体瞬时转染36h后,将细胞裂解,然后利用GloMaxTM 96 Microplate Luminometer发光检测仪分别测定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。共转pRL-SV40质粒作为内对照用来校正转染效率,以Firefly luciferase与Renilla luciferase活性的比值作为荧光素酶的相对活性,进行不同样品间的比较。9.细胞生物学实验[11 MTT实验：将1x103个细胞接种于96孔板中,每孔体积200μl,每组5孔,同时设空白对照,分别培养1、2、3和4天。每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃培养4h后终止培养,小心吸弃孔内培养基,加入二甲基亚砜150μl,室温孵育10min,使结晶物充分溶解,以空白对照孔调零,酶标仪上490nm测定各孔吸光度值(OD值),以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。[21平板克隆形成实验：接种200个细胞到6孔板中,保证细胞分散均匀,培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去培养基,甲醇固定后结晶紫染色,显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数x100%。[3]细胞周期检测：采用碘化丙锭(propidium iodide, PI)单染法检测细胞周期分布。将细胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式细胞仪检测。10.动物实验分别将过表达miR-26a的C666-1/miR-26a和对照组细胞C666-1/con随机接种于10只裸鼠后背部皮下,接种细胞数为5×105,每组包括5只。每两天用游标卡尺测量肿瘤的长短径一次,按如下公式计算肿瘤体积：v=(D×d2)/2,其中D代表肿瘤最长径,而d代表肿瘤最短径。待肿瘤体积超过500mm3,将实验动物处死,肿瘤组织取出后经福尔马林固定,石蜡包埋,切片后HE染色,光学显微镜观察。11.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,免疫组化的检测结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野,如果核阳性的肿瘤细胞数超过50%,则认为该样本阳性。然后,按照细胞染色强度进行评分：棕褐色3分,棕黄色2分,淡黄色1分,无着色0分。12.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。MTT实验和动物实验皮下成瘤体积的比较采用析因设计的方差分析；免疫组化染色强度的比较采用Mann-Whitney U检验；鼻咽癌组织中miR-26a和EZH2表达水平的相关性分析采用Spearman相关系数；其他实验中涉及到两组数据之间的比较均采用两独立样本的t检验,而三组或三组以上数据的比较均采用单因素方差分析,其多重比较采用SNK法。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.鼻咽癌中miR-26a表达特性的鉴定荧光定量PCR结果显示,在7种鼻咽癌细胞株,即5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和]HNE-1,miR-26a的表达均低于永生化鼻咽上皮细胞NP69(F=8.875,P<0.001);而在18例非角化未分化型鼻咽癌组织中,miR-26a的平均表达水平比16例鼻咽慢性炎组织降低60%(t=-6.976,P<0.001)。上述实验结果表明,miR-26a在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,为进一步研究其生物学功能提供了初步依据。我们推测,3p LOH可能是引起鼻咽癌中miR-26a表达下调的最重要机制,尚有待进一步证实。2. miR-26a过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响选取未分化鼻咽癌细胞株C666-1和低分化细胞株HNE-1作为细胞模型,研究miR-26a表达改变对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。首先,瞬时转染miR-26a mimic和inhibitor?荧光定量PCR检测miR-26a表达的改变,结果发现,在C666-1和HNE-1中转染miR-26a mimic后,miR-26a的表达分别增高了4.99(t=-9.650,P=0.001)和5.47倍(t=-11.307,P<0.001)；而转染anti-miR26a后,miR-26a的表达分别降低了85%(t=8.175,P=0.001)和80% (t=8.143,P=0.001)。该结果显示,瞬时转染miR-26a mimic和antimiR-26a可有效上调或下调miR-26a的表达。随后,通过MTT实验和细胞周期检测观察miR-26a表达改变对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。MTT实验结果发现,转染miR-26a mimic 96h后,C666-1和HNE-1细胞的生长速度分别降低了42%(t=21.682,P<0.001)和45%(t=26.662,P<0.001)；而转染anti-miR26a 96h后,两种细胞的生长速度分别加快了55%(t=-40.993,P<0.001)和47%(t=-28.592,P<0.001)。细胞周期分布显示,miR-26a过表达使C666-1细胞G1期细胞比例显著增高22%(t=-15.128,P<0.001),而S比例显著降低(t=13.173, P<0.001), G2+M期细胞比例无显著改变；而干扰miR-26a抑制其表达,细胞周期分布无显著差异(P>0.05)。该结果表明,miR-26a过表达通过诱导细胞周期G1期阻滞,抑制鼻咽癌细胞增殖。在此结果的基础上,通过构建miR-26a漫病毒表达载体,病毒包装浓缩,以不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI),分别感染C666-1和HNE-1细胞,荧光定量PCR检测miR-26a的表达,从而确定慢病毒感染鼻咽癌细胞的最佳MOI。结果表明,当MOI=100时,miR-26a的表达在C666-1和HNE-1中分别增高了9.46倍(F=152.822,P<0.001)和10.83倍(F=152.871,P<0.001),差异具有显著性,故后续实验采用MOI=100作为最佳感染复数。依据慢病毒载体所携带的GFP标记,采用流式细胞仪分选(fluorescence activated cell sorter, FACS)获得GFP阳性细胞群,建立稳定过表达miR-26a的鼻咽癌细胞株C666-1/miR-26a和HNE-1/miR-26a。利用该细胞株,通过平板克隆形成实验检测了miR-26a过表达对癌细胞克隆形成能力的影响。结果发现,miR-26a过表达使C666-1和HNE-1细胞的克隆形成率分别降低44%(t=25.154,P<0.001)和42%(t=-22.321,P<0.001)。MTT实验和细胞周期检测的结果与瞬时转染结果相一致,即miR-26a过表达通过诱导G1期阻滞抑制癌细胞增殖。此外,我们还将C666-1/miR-26a细胞接种裸鼠皮下,建立鼻咽癌异位移植瘤模型,进一步研究miR-26a过表达对鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响。结果表明,接种后第9天成瘤能力出现显著性差异,C666-1/miR-26a细胞所形成的肿瘤体积显著小于对照细胞(t=-6.649,P<0.001)。至第15天,接种C666-1/miR-26a细胞形成的肿瘤体积比对照组细胞的肿瘤体积降低45%(t=-15.605,P<0.001),且免疫组化结果发现,miR-26a过表达后显著降低了Ki-67和PCNA的表达(P<0.05)。以上结果显示,miR-26a参与了鼻咽癌的发病机制,其表达失调与鼻咽癌细胞的体外增殖和体内成瘤能力密切相关,在鼻咽癌中扮演候选抑癌基因角色。3. miR-26a抑制鼻咽癌细胞增殖相关分子机理的探讨利用miRBase、TargetScan和miRanda三大数据库对miR-26a进行靶基因预测,结果发现3个数据库均预测组蛋白甲基转移酶EZH2 (Enhancer ofZeste Homolog 2)为miR-26a的靶基因,且得分较高,结果可靠。在生物信息学预测的基础上,推测EZH2可能是miR-26a的靶基因。于是,我们构建了重组质粒pGL3-wt EZH2 3’UTR和突变质粒pGL3-mut EZH2 3’UTR,以便进行双荧光酶报告基因实验。将上述重组质粒和miR-26a mimic、anti-miR26a共转染C666-1细胞,检测荧光素酶活性,结果发现pGL3-wt 3’UTR和miR-26a mimic共转染可显著降低荧光素酶的活性(t=-13.026,P<0.001),而将该重组质粒与antimiR-26a共转染后可显著增强荧光素酶的活性(t=-8.370,P=0.001),表明miR-26a与EZH23’UTR可特异性结合。随后,通过采用5个不同的MOI,观察miR-26a不同程度过表达对EZH2表达的影响,结果发现在C666-1细胞中,miR-26a过表达可显著抑制EZH2mRNA (F=88.649, P<0.001)和蛋白水平的表达,且呈剂量依赖性,即miR-26a过表达程度越高对EZH2的抑制作用越明显,在HNE-1细胞中也获得类似的结果(F=442.510,P<0.001)。相反,沉默miR-26a后可显著上调EZH2 mRNA和蛋白的表达(P<0.001)。此外,我们还检测了鼻咽癌组织中EZH2的表达,结果显示EZH2在鼻咽癌组织中表达上调,其平均表达是水平慢性鼻咽炎组织的2.12倍(t=-5.818,P<0.001),且EZH2 mRNA的表达与miR-26a在同一组鼻咽癌组织中呈负相关(r=-0.874,P<0.001)。以上结果证实,在鼻咽癌中EZH2为miR-26a的靶基因。在以上结果的基础上,又分别过表达和干扰EZH2,观察EZH2表达改变对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。MTT实验结果表明,在实验第4天,EZH2沉默后使C666-1细胞的增殖能力降低41%(F=612.085,P<0.001),与miR-26a过表达引起类似的抑制作用。而细胞周期检测的结果同样显示,干扰EZH2与过表达miR-26a均可诱导G1期阻滞(F=223.443,P<0.001)。随后,我们在C666-1/miR-26a细胞中进一步过表达EZH2,结果发现转染96h后EZH2过表达可显著逆转miR-26a的增殖抑制作用,使细胞的生长速度趋于正常(F=1078.465,P<0.001),使G1期细胞比例显著降低(F=360.732,P<0.001)。该结果表明,miR-26a抑制鼻咽癌细胞增殖的生物学功能是通过调控EZH2的表达来实现的。众所周知,miRNA功能的发挥是通过调控成百上千个靶基因所构成的庞大网络来实现的,因此,为了深入解析miR-26a发挥功能的分子机理,我们进一步检测了C666-1细胞中p53和pRb信号通路以及c-myc等一系列细胞周期调控因子的表达。结果表明,miR-26a过表达和EZH2沉默均可抑制CCND3、CCNE2、CDK4、CDK6和c-myc,同时上调p14ARF和p21CIP1,而对CCND1、CCNE1、CDK2、p16INK4A、p53和pRb的表达无影响。此外,EZH2过表达还可逆转miR-26a对上述基因的抑制作用。我们还发现miR-26a过表达可抑制CCND2,而EZH2对该基因并无调控作用,提示该基因可能为miR-26a在鼻咽癌中的另一靶基因。综合以上结果,阐明了miR-26a参与鼻咽癌发病的分子机理,即通过调控靶基因EZH2,进一步影响G1/S关键点相关调控因子的表达,从而引起G1期阻滞抑制鼻咽癌细胞增殖。结论1. miR-26a在鼻咽癌细胞株和组织中表达下调。2. miR-26a参与了鼻咽癌的发病机制,其表达失调影响癌细胞的体外增殖和体内成瘤能力,发挥候选抑癌基因的功能。3.在鼻咽癌中,EZH2为miR-26a的靶基因。4. miR-26a通过调控靶基因EZH2,进一步影响细胞周期相关调控因子的表达,从而诱导G1期阻滞抑制鼻咽癌细胞增殖。