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反当动物瘤胃拥有数量巨大且结构复杂的微生物系统,是物质代谢的的主要场所。为了满足泌乳反刍动物的高泌乳性能,常饲喂含精料较高的日粮,但往往会引发反刍动物的营养应激。在应激激素皮质醇升高的基础上,本文探索了长期或短期饲喂高精料日粮对瘤胃细菌菌群结构、代谢产物的影响及瘤胃上皮相关基因的表达变化并研究了不同浓度人工合成皮质激素——地塞米松对体外培养瘤胃微生物发酵的影响。1长期或短期饲喂高精料日粮对瘤胃细菌菌群的结构、代谢产物及瘤胃相关基因表达的影响试验选用泌乳期关中奶山羊15只,体重与泌乳量相近,随机分为低精料日粮对照组(精粗比35:65)和高精料组(精粗比65:35)。饲喂15周后,将对照组羊分为2组,一组继续饲喂低精料日粮(精粗比35:65,LC,n = 5),另一组饲喂高精料日粮,饲喂期4周作为高精料日粮短期饲喂组(精粗比65:35,HS,n = 5),高精料日粮长期组饲喂期为19周(精粗比65:35,HL,n= 5)。实验结束后采集瘤胃液、血液和瘤胃上皮组织等样品。提取瘤胃液微生物基因组DNA,对细菌V3-V4区域进行454焦磷酸测序,并用绝对定量real-time PCR方法检测瘤胃液中细菌(Bacteria)、原虫(Ciliate)、产甲烷菌(Methanogens)及真菌(Anaerobic fungi)的含量;对瘤胃液样品进行GC-MS代谢组学检测;气相色谱法检测挥发性脂肪酸含量;采用放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)法检测血液中的激素水平;采用经典的生化分析法测定血浆中组胺(Histamine)、瘤胃液中乳酸(Lactic acid)、微生物蛋白(Microbial crude protein,MCP)及氨态氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)的含量;Real-time PCR 法检测瘤胃上皮组织中炎症、VFA转运载体及凋亡相关基因的表达。结果显示:与LC对照组比较,HS组山羊静脉血中皮质醇浓度无显著变化(P>0.05),但长期饲喂高精料导致循环血中皮质醇浓度显著低于对照组和短期组(P<0.05)。HL组山羊血液中组胺浓度显著高于对照组(P<0.05),但短期组未出现明显变化(P>0.05)。饲喂高精料日粮对瘤胃液中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和总挥发性脂肪酸含量无显著影响,但与对照组相比,HL组乙酸/丙酸比例显著降低(P<0.05),而乳酸含量显著升高(P<0.05),HS组和HL组瘤胃液中NH3-N、MCP和LPS含量均显著高于对照组(P<0.05),但HS组和HL组之间无显著性差异(P>0.05)。代谢组学分析瘤胃液成分表明,LC、HS、HL三组两两之间代谢产物存在明显差异(P<0.05)。与对照LC组相比,短期HS组与长期HL组的细菌菌群丰度指数(Chao1和ACE)和细菌菌群多样性指数(Shannon)都显著降低(P<0.05)。采食高精料时间的长短对大部分门类细菌的相对比例无显著影响,但与对照组相比,短期饲喂高精料显著下降了 Cyanobacteria的相对比例(P<0.05),长期组Verrucomicrobia相对比例显著低于短期组(P<0.05)。高通量主成分分析表明,高精料饲喂对属水平瘤胃细菌菌群组成有较大影响,但长期组与短期组在属水平上的差异不显著(P>0.05)。饲喂高精料持续时间对瘤胃上皮组织炎症相关基因表达的影响:(1)与对照LC组相比,短期HS组与长期HL组TLR4 mRNA表达量显著升高(P<0.05),IL-8 mRNA表达量均显著低于对照组(P<0.05),HS组MyD88 mRNA表达量明显下降(P<0.05),HL组IL-10mRNA表达量显著上调(P<0.05)。然而,饲喂高精料对瘤胃上皮组织中 TNF-α、TLR2、INF-γ、IL-1αmRNA 的表达量无显著影响(P>0.05)。(2)饲喂高精料对瘤胃VFA转运载体相关基因表达的影响,与LC相比,HS组和HL组瘤胃上皮组织中NHE2和NEH3 mRNA表达量都显著的升高(P<0.05),但HS和HL组之间无显著差异(P>0.05),这与Na/KATPasemRNA表达量结果一致;但对MCT1和MCT4mRNA表达量无明显影响(P>0.05)。(3)饲喂高精料对瘤胃上皮细胞凋亡相关基因表达的影响,HS和HL组瘤胃上皮中Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达量较对照组显著上调(P<0.05),HL组瘤胃上皮组织中Bax基因表达显著上调(P<0.05)。与LC组相比,HS组Caspase-3活性显著升高(P<0.05),但长期饲喂高精料未对其活性产生影响(P>0.05)。以上结果提示:长期和短期饲喂高精料日粮显著降低瘤胃液中细菌多样性、改变瘤胃微生物组成及瘤胃微生物的发酵类型、增加瘤胃内有害代谢产物;并引起瘤胃上皮细胞应激和炎症反应,且长期饲喂高精料日粮较短期饲喂的影响更为明显。2地塞米松对体外培养瘤胃微生物发酵功能的影响采用瘤胃液体外人工发酵模型,研究化学合成的糖皮质激素——地塞米松对瘤胃微生物发酵的影响,以探索瘤胃液中皮质醇浓度升高对其发酵功能的调节作用。实验分为对照组(CON)、乙醇溶剂组(ETH)、低浓度地塞米松组(1ng/mL,LD)、中浓度地塞米松组(5ng/mL,MD)和高浓度地塞米松组(10ng/mL,HD),每组3个重复。用精粗比40:60的日粮作为培养底物,连续培养24 h。分别在0、2、4、8、12和24 h采集培养液测定pH值;气相色谱法检测挥发性脂肪酸含量;生化分析法测定瘤胃液中乳酸(Lactic acid)、微生物蛋白(Microbial crude protein,MCP)及氨态氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)的含量;绝对定量PCR的方法检测瘤胃中部分细菌丰富度。结果显示:地塞米松和发酵时间显著影响瘤胃液pH,且两因素间存在显著互作效应(P<0.01)。12 h时HD组pH极显著低于CON组(P<0.01),显著低于ETH组(P<0.05)。24 h时,HD组的pH低于6.0,且极显著低于CON组和ETH组(P<0.01)。地塞米松和发酵时间极显著升高瘤胃液中总挥发性脂肪酸的浓度(P<0.01),但二者无交互效应。HD组于发酵24h时总挥发性脂肪酸显著高于CON组(P<0.05)。地塞米松和发酵时间极显著升高乙酸的浓度,且存在极显著的互作效应(P<0.01)。24 h时乙酸浓度显著或极显著高于对照组和低剂量地塞米松处理组(P<0.05或P<0.01),而丁酸含量则低于CON与ETH组,丙酸浓度与其他组无显著差异。地塞米松和发酵时间极显著影响瘤胃液中乳酸浓度(P<0.01),但二者无交互效应。随发酵时间的延长,CON、ETH、LD和MD组的乳酸浓度均先升高后降低,HD组则逐渐下降。NH3-N浓度仅受发酵时间的影响,而地塞米松对其无显著影响。发酵期间各组NH3-N浓度均逐渐升高,且培养后期(12～24 h)每组之间浓度差异不明显。地塞米松、发酵时间和二者综合效应均极显著影响瘤胃液MCP的浓度(P<0.01)。MCP呈现先增长后下降的变化,培养后期(12～24 h)各组MCP量大幅度下降,24h时各组之间无明显变化。Real-time PCR检测结果显示,试验期间每组细菌总量随发酵时间均逐渐增加。同一时间点,各组之间产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、牛链球菌、普雷沃氏菌比例高低没有变化。24h时HD组黄色瘤胃球菌比例显著高于CON、ETH和LD组(P<0.05)。结果提示,糖皮质激素显著加快瘤胃的发酵速度并对微生物区系存在一定的影响。