论文部分内容阅读
很多肝脏疾病包括急慢性肝炎、重型肝炎、酒精性肝病等都不同程度的出现肝细胞的坏死和再生过程,通过减少肝脏的损伤,促进肝脏的再生可以有效地缓解患者的病情。因此了解肝再生的调控机理对发现与肝损伤和再生过程相关疾病的治疗和药物开发具有重要意义。为更好的了解肝再生的调控机理,我们应用了CCl4诱导小鼠肝再生动物模型,利用基因芯片检测整个肝再生过程中的不同时间点肝脏内的基因表达谱,并提出肝再生调控稳态模型假说,从生物过程的通路和单个功能基因水平上对肝再生调控稳态模型假说进行验证。本论文研究分为两个部分:第一部分为CCl4诱导肝再生过程中基因表达谱的研究;第二部分为分泌性磷酸化蛋白-1(Secreted phosphoprotein 1,Spp1)对CCl4诱导肝再生过程调控作用的研究。第一部分为了研究小鼠肝再生过程中的基因表达谱变化,我们给9周龄的雄性C57BL/6小鼠腹腔注射CCl4(花生油稀释成25%浓度使用),剂量为1ml/kg体重,在注射CCl4后的0、0.5、1.5、4.5、7天时间点分别采样,每次处死3只,将肝脏取出后抽取RNA用于基因芯片杂交,在每个小鼠肝脏的相同位置上,取一小块用10%的福尔马林溶液固定后用于制作石蜡切片和用增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen, PCNA)抗体进行免疫组化分析。美国埃菲公司的Genechip? Mousegenome 430 2基因芯片的被用来检测样品中的基因表达谱,以0时间点为对照,对于其他4个时间点中,在至少一个时间点的表达变化大于或等于2倍的基因被筛选出来,用于聚类分析和生物学过程与功能分析,并对生物学过程分析结果中的氨基酸、尿素循环和氮元素代谢通路进行了验证。结果发现在肝再生期间,共有2110个基因的表达水平发生了变化,这些基因根据其在肝再生期间的表达变化动态被分为14类,其中,先上升后下降和先下降后上升的基因分别占总数的11.51%和35.45%。在这些表达发生变化的基因中,调控信号转导基因包括spp1在内有217个,转录因子有117个,找出了符合稳态模型的基因,建立了肝再生稳态表达模型的基因表达谱,并揭示了肝再生过程中血液中氨基酸水平上升的分子机理。第二部分小鼠spp1基因被克隆以及构建了spp1原核与真核表达载体,并利用真核表达载体直接转染小鼠骨骼肌来研究spp1基因在小鼠体内过量表达对CCl4诱导肝再生模型小鼠肝再生的影响,也利用原核表达载体通过大肠杆菌BL21表达重组小鼠SPP1蛋白(recombinant mouse SPP1, rmSpp1),纯化出纯度达到98%的具有生物活性的rmSpp1。为了研究Spp1对肝再生模型小鼠的调控作用,通过给予CCl4诱导肝再生小鼠分别注射rmSpp1和抗小鼠Spp1抗体。8周龄的雄性小鼠被随机分成4组,每组20只,具体处理如下:组1:实验开始时,小鼠腹腔注射CCl4(花生油稀释成25%浓度使用),剂量为1ml/kg体重,每只小鼠注射CCl4后立即皮下注射重组小鼠Spp1蛋白,剂量是1mg/kg,试验开始后1、3、5、7天时间点分别采样,每个时间点每组处死5只小鼠,收集血样分离血清,检测血清谷丙转氨酶(Alanine amino-transferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)活性,抽取肝脏RNA,取相同位置的肝组织一小块立即用10%的福尔马林溶液固定,制作组织切片分析组织形态学变化,另外用PCNA免疫组化检测肝细胞增殖情况;组2处理同组1,注射等体积的生理盐水作为组1的对照;组3处理方法同组1,每只小鼠皮下注射20μl抗小鼠Spp1抗体的家兔血清;组4处理方法同组3,注射等体积的正常家兔血清作为组3的对照。结果显示在3天时注射重组小鼠Spp1蛋白的模型小鼠体内ALT活性显著低于对照组(78.6±59.0 vs 186.6±109.0 IU/L,p=0.018),肝脏坏死区面积也显著小于对照组(11.7±3.4% vs 21.0±4.4%,p=0.0006)。第3天时,小鼠的肝细胞增殖也显著高于对照组(7.1±1.2 vs 3.8±1.0/ 0.01mm2, p=0.002)。相反,第3天,注射抗Spp1抗体小鼠体内的ALT活性却显著高于对照组(426.9±166.5 vs 90.8±61.9, p=0.008),在3天和5天时肝脏的坏死面积比例也都显著高于对照组(24.1±4.4% vs 8.6±1.4%,p=0.014与3.4±0.29% vs 1.7±0.45%,p=0.007)。但是第3天时注射抗Spp1抗体小鼠的肝细胞的PCNA阳性细胞数也显著高于对照组(6.0±1.7 vs 3.3±0.7/ 0.01mm2,p=0.03)。结论:通过基因芯片对肝再生期间肝脏内基因的表达水平进行动态分析,筛选出符合肝再生稳态模型假说的基因,从而有效聚焦了调控肝再生的研究范围,从氨基酸代谢相关通路基因表达水平的变化揭示了肝再生过程中氨基酸水平上升的机理。通过对符合肝再生调控稳态模型的基因spp1进行进一步的功能研究。结果表明了spp1在肝脏损伤与再生过程中,可以有效保护肝细胞,减少细胞坏死和促进肝细胞的增殖,有效地促进肝脏的再生。