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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、杀虫毒力有限等缺点,因此,必须通过生物技术等手段寻找新的基因资源,并且构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。目前,发掘新的杀虫基因,研究其晶体蛋白结构和作用机制都是国内外研究的热点,本论文围绕对鞘翅目害虫高毒力Bt基因的克隆、工程菌的构建、杀虫晶体蛋白杀虫特异性机理等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:1、对蛴螬高杀虫活性cry8类基因的克隆:从自行筛选的菌株Bt145中克隆了cry8Ga2新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,构建了新的Bt工程菌株HD8G2,生物活性测定结果表明,工程菌株HD8G2与野生菌株均对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟表现出杀虫活性,LC50分别为1.25×108 cfu/g和5.59×108 cfu/g。从自行筛选的菌株BtSU4中克隆了cry8Ha1和cry8Ia1新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,获得了两株新型Bt工程菌株HD8H和HD8I。室内生物活性测定结果表明,HD8H和HD8I都对暗黑鳃金龟幼虫有较高的杀虫活性,LC50分别为2.19×1010cfu/g和8.50×109 cfu/g,对鳞翅目害虫无杀虫活性;从HD8H提取的蛋白经胰凝乳蛋白酶活化后,对叶甲科害虫大猿叶甲表现出较高的杀虫活性,LC50为18.00μg/ml。通过RT-PCR以及Western杂交证实cry8Ha1和cry8Ia1基因在宿主菌株BtSU4中均能正常的表达。两个新基因分别申请了国家发明专利,为其应用奠定了基础。2、对鞘翅目金龟甲科和叶甲科害虫工程菌的构建:将对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的cry3Aa7基因,通过电击转化到对蛴螬高毒力的野生菌株BtSU4和HBF-1中,得到工程菌株3A-SU4和3A-HBF。室内生物活性测定结果表明,两株工程菌不仅对蛴螬表现出较高毒力,而且还获得对叶甲科害虫的杀虫活性。工程菌3A-SU4对马铃薯甲虫、大猿叶甲和暗黑鳃金龟幼虫的LC50分别为2.62μg/ml、1.25μg/ml和3.60×108 cfu/g;3A-HBF对马铃薯甲虫、大猿叶甲和铜绿丽金龟幼虫的LC50分别为1.74μg/ml,1.10μg/ml和0.73×108 cfu/g,两株工程菌扩大了对鞘翅目害虫的杀虫谱,具有良好的开发和应用前景。3、Cry8类蛋白杀虫特异性机理的研究:从蛋白的结构、蛋白的活化、蛋白与昆虫体内受体的结合三个方面进行Cry8类蛋白杀虫特异性机理的初步探索。通过结构域互换的方法,得到Cry8Ca2和Cry8Ea1两种蛋白不同结构域组合的8种杂合蛋白,分析8种杂合蛋白对蛴螬的杀虫活性与其结构的对应关系,其中工程菌株HD (3+15()含由Cry8C的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8E的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)、HD (7+11) (含由Cry8E的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8C的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)、HD (6+10)(含由Cry8E的DomainⅠ和LoopⅠ及Cry8C的DomainⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因)在浓度为1010 cfu /g时,对铜绿丽金龟幼虫的较正死亡率分别为44%、36%和32%。但所有的杂合蛋白都对暗黑鳃金龟幼虫失去了杀虫活性。通过Cry8Ha1、Cry8Ia1、Cry8Ga1和Cry8Ga2四种蛋白被暗黑鳃金龟中肠液与胰凝乳蛋白酶消化,胰凝乳蛋白酶活化的Cry8Ha1蛋白对大猿叶甲幼虫有较高的杀虫活性,而活化的Cry8Ga1、Cry8Ga2和Cry8Ia1蛋白对大猿叶甲幼虫无杀虫活性。用生物素标记的Cry8Ha1和Cry8Ia1蛋白均能与暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫的BBMV结合,但是这两种蛋白仅对前者具有杀虫活性。