本文主要从以下两部分展开论述：　　第一部分 蛋白磷酸酶5(PP5)在p53去磷酸化中的作用　　蛋白质可逆的磷酸化和去磷酸化是生物体内重要的共价修饰方式之一。在哺乳动物细胞生命周期中，大约1/3的蛋白质发挥功能需要这种相互作用。磷酸化和去磷酸化的协调作用在p53蛋白的生理功能过程中同样发挥着重要的作用。相对于p53的磷酸化修饰，p53的去磷酸化修饰的研究相对薄弱。目前研究发现，有多个磷酸酶与p53的去磷酸化有关，它们包括PP2A，PP1，Wip1，Cdc14和PP5等。然而除了Wip1外，大多数磷酸酶调节p53的磷酸化作用的研究均来自于体外生化实验，且大部分没有得到动物实验的验证。PP5是一个广泛表达的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在调节细胞生长、增殖、分化以及在压力条件下对细胞的生存都起着重要的作用。PP5是由单一的基因编码的多肽链，包含三个主要的结构域，分别是三个含有三十四个氨基酸组成的重复序列TPR结构域，一个催化结构域和一个调节结构域。由于C-端存在一个与TPR结构域相互作用的小的自我抑制结构，这种相互作用可以阻止PP5催化结构域与底物结合，因此正常生理条件下PP5的磷酸酶活性很低。体外实验证明如果除去PP5 C-端的13个氨基酸残基，其催化活性可以大约提高10倍。　　目前发现PP5可以和多种蛋白质结合参与调节各种生物功能，包括糖皮质激素受体(GR)/热休克蛋白90（GR/HSP90）复合体，CDC16/CDC17复合体，隐花色素2，Hsp90依赖的eIF2α蛋白激酶，ASK1，DNA-PKcs，ATM/ATR，G蛋白12α/G13α和Raf1等等。在一些临床研究中发现PP5在肿瘤发生中起着重要作用，如在乳腺癌和套细胞淋巴瘤中PP5有很高的表达，遗传学的研究也发现PP5基因与人类骨肉瘤存在相关性。体外研究发现组成性增加PP5的表达可以使激素依赖的肿瘤细胞不依赖于激素的生长。利用反义寡核苷酸抑制PP5表达后，细胞的生长受到抑制，同时发现p53下游基因p21的表达增加，PP5对p53的功能存在负调控作用。在p53的去磷酸化过程中，有研究认为是PP2A而不是PP5起着重要作用。　　从目前的研究可知，一方面PP5对p53有负调控的作用，但详细的调节机制还很不清楚，而且未在动物实验中得以验证，另一方面，PP5促进某些肿瘤的生长是否与p53有关还有待进一步研究。　　目的：本课题着重研究PP5与p53之间的调节关系，拟发现PP5对p53介导的信号通路以及肿瘤发生的作用，为p53相关肿瘤的预防和治疗提供新的思路。　　方法：利用已有的PP5和p53 KO小鼠动物模型，用实时定量PCR和免疫印迹等方法分析PP5或p53 KO不同组织p53或PP5的表达情况。分离野生型和PP5 KO小鼠原代成纤维细胞，用实时定量PCR和免疫印迹分析p53及p53调节基因的表达情况，研究PP5对p53功能的调节。分离野生型和PP5 KO原代骨髓低密度单核细胞，用流式细胞仪分析遗传毒性试剂DOX处理后PP5 KO对细胞凋亡的影响。用逆转录病毒pMSCV-sh-p53介导的RNA干扰下调PP5 KO原代骨髓低密度单核细胞p53的表达来研究p53在DOX处理后对细胞凋亡的影响，通过这些研究结果分析p53在PP5生物功能中的作用。组织化学研究PP5 KO小鼠模型和野生对照小鼠在DOX给药后心脏病理的变化，进一步分析在病理上p53对PP5功能的调节作用。体外用HEK293T细胞系进行PP5对p53的去磷酸化分析。体外用PP5对DNA-PK磷酸化的p53进行去磷酸化分析，研究PP5是否可以直接使p53去磷酸化。利用H1299细胞系共转染p53和PP5表达质粒，用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down技术研究PP5和p53的相互作用。用H1299细胞系进行染色质共沉淀（ChIP）分析p53和PP5启动子区保守结合位点的结合情况，并进一步用荧光素酶报告基因分析p53对PP5表达情况的影响。　　结果：PP5 KO小鼠不同组织p53的蛋白表达水平及下游调节基因表达上调，相似的结果也从原代分离的骨髓低密度单核细胞和原代成纤维细胞中得到，而p53 KO小鼠不同组织及分离的原代成纤维细胞中PP5蛋白表达水平也上调。遗传毒性试剂DOX对PP5 KO骨髓低密度单核细胞处理及PP5 KO小鼠给药的心脏病理学研究表明PP5KO细胞细胞凋亡增加、心脏病理加重，且PP5的功能由p53介导。免疫共沉淀和GST pull-down分析表明PP5和p53有一个直接的相互作用，磷酸化和去磷酸实验分析表明PP5可以在多个位点使p53去磷酸化。染色质共沉淀技术分析表明p53直接和PP5基因启动子区的保守结合位点相结合，而荧光素酶报告基因进一步分析表明p53对PP5基因表达具有抑制作用。　　结论：本课题研究表明:一方面PP5可以和p53直接结合，调节p53的稳定性和活性，而且p53也参与PP5的相关生物学功能，另一方面p53可以和PP5启动子区的保守结合位点结合抑制PP5基因的表达。因此PP5和p53有一个相互的负调控作用，而这种调控的生物学意义还需要进一步研究。　　第二部分 hNTCT转基因小鼠模型的建立　　HBV感染的细胞和种属特异性限制了HBV的生物学特性及其致病机制的研究以及慢性感染的抗病毒治疗。在细胞培养方面，体外的细胞培养系统如原代肝细胞和建立HBV感染细胞系不能够进行有效的复制和扩增而且重复性较差。而在动物模型方面，黑猩猩是HBV可以直接感染的极少数动物模型之一。HBV感染黑猩猩在阐明HBV生物学特性、致病机制及疫苗和药物开发上贡献很大，然而由于资源的可利用性、昂贵、濒危状态，不适合作为HBV感染的动物模型。除了黑猩猩外，HBV还可以感染最低等的灵长类动物树鼩。树嗣感染HBV后，有急性感染和慢性感染，而且在一定条件下慢性感染可诱导肝癌的发生。然而，树鼩为远交系物种，遗传和免疫背景不清楚，而且资源有限，这些不利因素使其不能成为理想的动物模型。由于嗜肝病毒科病毒的寄主特异性，土拨鼠、鸭子和地松鼠相关病毒动物模型被用来作为HBV感染的替代动物模型，这些动物模型在阐明HBV复制等生物学特性中发挥了很大作用。　　因此，建立HBV感染方便经济可靠的小动物模型一直是研究者追求的目标。目前虽然用不同方法建立了多种小鼠动物模型，但都有明显的局限性，只适合某方面特定的研究。因此建立HBV感染合适的小动物模型依然是HBV研究要解决的关键问题之一。　　病毒对寄主的感染需要病毒抗原与寄主受体的相互作用，然而在HBV的研究中，病毒进入细胞这一基本的过程还不是很清楚。Yan等2012年报道称钠离子-牛黄胆酸共转运肽(NTCP，SLC10A1)是介导HBV进入细胞的功能性受体。NTCP是位于肝细胞基底膜的转运子，参与肝细胞对耦联胆酸的重吸收，在胆酸的肝肠循环中有重要作用。HBV大表面蛋白的preS1区和NTCP相互作用是HBV进入肝细胞的起始过程。最新的研究表明NTCP与HBV的感染特异性相关，而且NTCP的胆酸转运和HBV进入这两个功能是相互拮抗的。NTCP和胆酸结合抑制HBV的进入，反之依然。因此HBV的受体NTCP的发现不但为乙肝治疗提供了新的方法，而且为HBV感染动物模型的建立提供了新的思路。　　目的：构建了人NTCP(hNTCP)条件性表达的转基因小鼠，研究HBV能否感染hNTCP过表达小鼠，期望建立新的HBV感染小鼠模型，为HBV感染的病理学机制、预防和治疗研究提供新的动物模型。　　方法：采用Loxp/Cre系统构建hNTCP条件性过表达转基因小鼠，通过X-gal染色、PCR和实时定量PCR、免疫印迹及组织化学等方法鉴定构建小鼠hNTCP的表达情况。首建小鼠与C57遗传背景的Cre小鼠杂交得到F1代嵌合体小鼠，F1代嵌合体小鼠再与野生型的C57杂交，得F2代小鼠，选取F2代小鼠进行HBV感染实验。用ELISA和PCR等方法对HBV感染实验的小鼠进行HBV表面抗原及HBV DNA基因组的检测，研究HBV的感染情况。　　结果：用E2A-Cre构建的全身性表达hNTCP的转基因小鼠，出生后不欠死亡，无法进行HBV感染实验。实时定量PCR分析表明全身过表达hNTCP小鼠不同组织RNA表达水平很高。病理学分析表明，全身hNTCP的过表达会引起肺、肝脏和肾的病理变化。　　用Alb-Cre条件性肝脏特异表达hNTCP小鼠及E2A-Cre与首建小鼠交配的F1代小鼠进行HBV感染实验。ELISA结果表明，在HBV感染小鼠后第三天，很容易的检测到HBV的表面抗原，而在7天之后，检测不到表面抗原的存在。PCR检测7天、14天和28天肝脏和血液中HBV基因组DNA的存在情况，结果为阴性。　　结论：本研究表明全身性过表达hNTCP小鼠会引起多种器官病变并在出生后不久死亡。肝脏特异性表达hNTCP小鼠及E2A-Cre与首建小鼠交配的F1代小鼠不感染HBV。