第一部分粉防己碱预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其与表没食子儿茶素没食子酸酯比较研究目的:通过大鼠在体心肌缺血再灌注模型,观察粉防己碱预处理对缺血再灌注损伤心肌的保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯具有抗心肌缺血再灌注损伤和心肌细胞凋亡的作用,与表没食子儿茶素没食子酸酯进行比较,观察粉防己碱预处理对缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:建立在体大鼠心脏I/R损伤模型,将96只大鼠随机分为正常对照组(Sham组, n=16)、I/R损伤组(I/R组, n=20)、粉防己碱1组(TET1组, n=20)、粉防己碱2组(TET2组,n=20)、表没食子儿茶素没食子酸酯组(EGCG组,n=20);各组均测定大鼠心肌I/R损伤后血清乳酸脱氢酶(LDH)、心肌组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,采用HE染色及电镜观察各组心肌的病理变化。各组均测定心肌梗死范围(IS/AAR%,TTC法),比较各组间差异。结果:与Sham组比较,I/R组中MDA值、LDH值、IS/AAR %明显升高,SOD显著降低。与I/R组比较,TET1组、TET2组、EGCG组可显著降低IS/AAR%值[(23.28±4.38)%, (19.96±4.38)%, (24.86±4.67)% vs. (43.76±6.30)% ,均P﹤0.01]; LDH [(1329.54±250.21)U/L, (1305.76±266.44)U/L,(1418.62±276.17)U/L,vs. (2016.97±371.95) U/L,均P﹤0.01)]、MDA [(3.16±0.21) nmol/mg prot,(2.98±0.38) nmol/mg prot,(3.39±0.52)nmol /mg prot vs. (5.33±0.51) nmol/mg prot,均P﹤0.01)]均明显降低,而SOD值明显增高[(138.45±20.74)U/mg prot, (146.38±24.41)U/mg prot, (135.46±20.98) U/mg prot vs. ( 98.69±15.41) U/mg prot,均P﹤0.01)]。TET1组、TET2组、EGCG组可以显著减轻心肌缺血再灌注损伤的病理改变。与EGCG组比较,TET1、TET2、EGCG三组间MDA、LDH和SOD值无显著性差异(P>0.05)。结论:大鼠心肌缺血再灌注损伤可导致LDH值、MDA值升高、SOD降低,引起心肌病理改变及IS/AAR %升高,与EGCG比较,粉防己碱预处理可以抗心肌缺血再灌注损伤,保护心肌,其保护效果与EGCG相似。第二部分粉防己碱预处理对缺血再灌注心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC的影响目的:观察粉防己碱对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响及其对Bax、Bcl-2蛋白表达和线粒体中细胞色素C释放的影响,并观察粉防己碱对心肌细胞caspase-3变化的影响,初步探讨粉防己碱预处理对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的作用。方法:建立在体大鼠心脏I/R损伤模型,将143只大鼠随机分为正常对照组(Sham组,n=23)、I/R损伤组(I/R组,n=30)、粉防己碱1组(TET1组,n=30)、粉防己碱2组(TET2组,n=30)、表没食子儿茶素没食子酸酯组(EGCG组,n=30);实验结束后,用原位末端标记法(TUNEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)检测细胞凋亡,用免疫组化法检测Bax、Bcl-2蛋白表达和Western-blotting法检测胞浆细胞色素C表达,用RT-RCR法检测心肌细胞caspase-3 mRNA表达,并观察caspase-3活性变化,比较各组间差异。结果:与I/R组相比,TET1组、TET2组、EGCG组明显抑制心肌细胞凋亡,AI明显降低[(8.62±2.45)%,(7.95±2.28)%,(10.62±3.09)% vs. (19.36±5.28)%,均P﹤0.01];与I/R组相比,TET1组、TET2组、EGCG组Bcl-2表达明显增加,Bax明显减少,且Bcl-2/ Bax值显著高于I/R组(P<0.01);I/R组心肌细胞胞浆细胞色素C显著增多(P<0.01),经TET1、TET2和EGCG预处理后,可明显抑制细胞色素C从线粒体向胞浆的释放(P<0.01);TET1、TET2和EGCG预处理后,可明显减少心肌细胞caspase-3的表达和活性(P<0.01)。结论:粉防己碱可通过抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡来参与缺血再灌注心肌损伤的保护,粉防己碱抗心肌细胞凋亡可能与上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白表达,升高Bcl-2/ Bax比值,抑制Cyt C从线粒体的释放,减少caspase-3在心肌组织中表达和活性有关。第三部分粉防己碱预处理对缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡影响及其机制研究第一节新生大鼠体外心肌细胞培养和缺氧/复氧模型建立目的:通过体外培养新生大鼠心肌细胞,构建新生大鼠心肌缺氧/复氧损伤模型,在细胞水平模拟大鼠心肌缺血再灌注(SI/R)损伤,为研究粉防己碱对新生大鼠缺氧/复氧损伤影响提供平台。方法:分离新生1-3天的乳鼠心室肌,在培养基中培养3-4天后,行缺氧2h/复氧24h,建立缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation)心肌细胞损伤模型。在缺氧前、缺氧2h末期和复氧24h末期利用2,4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)及黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)检测超氧化物歧化酶(SOD)含量并进行比较,以证实缺氧/复氧损伤模型构建成功。结果:新生1-3天的乳鼠心室肌,在培养基中培养3-4天后,在倒置显微镜下可观察到有搏动的心肌细胞。培养3-4天的心肌细胞在实施缺氧期2h后,LDH和MDA均较缺氧前有所升高,SOD降低(P<0.01);而给予复氧期24h后,LDH和MDA明显高于缺氧期,而SOD进一步降低(P<0.01),对照组的上述指标在相应时间点未见明显改变(P>0.05)。结论:通过给新生大鼠体外培养心肌细胞行缺氧2h/复氧24h后,可明显造成心肌细胞损伤,以此模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤。第二节粉防己碱对缺氧/复氧诱导新生大鼠心肌细胞凋亡、PKC表达的影响及机制研究目的:通过建立的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,观察粉防己碱对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡及PKC的影响,探讨粉防己碱抑制心肌细胞凋亡的信号转导机制。方法:通过给原代培养乳鼠心肌细胞行缺氧2h/复氧24h ,建立缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation)心肌细胞损伤模型。将培养的心肌细胞分为正常对照(CON)组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(AP)组、粉防己碱预处理(TET)组、缺氧预处理+PKC抑制剂chelerythrin(eAP+CHE)组、粉防己碱+PKC抑制剂chelerythrine(TET+CHE)组,共6组。于复氧24h后,检测LDH活性和心肌细胞MDA、SOD含量,采用原位末端标记法(TUNEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)标测心肌细胞凋亡,检测心肌细胞PKC mRNA的表达量及PKC活性,用免疫印迹法(Western blotting)检测胞浆CytC表达,并检测心肌细胞caspase-3 mRNA表达量及活性,比较各组间差异。结果:与A/R组相比,AP组、TET组中LDH活性、MDA含量、凋亡指数(AI)显著降低,SOD显著升高(P<0.01);PKC的mRNA的表达量和活性显著增加,心肌细胞胞浆中CytC减少,心肌细胞caspase-3 mRNA表达量减少、caspase-3活性降低有显著性差异(P<0.01);经chelerythrine处理后,再给予AP或TET预处理,则PKC的mRNA的表达量和PKC活性显著下降,可见胞浆中CytC增加,心肌细胞caspase-3 mRNA表达量增加,caspase-3活性增强,凋亡指数(AI)增加(P<0.01)。结论:粉防己碱预处理可减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,PKC抑制剂chelerythrine处理后,可显著降低粉防己碱的保护作用,因此PKC的信号传导途径可能是粉防己碱抑制缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的关键环节。