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目的:通过进行体外的细胞实验,探究培美曲塞(Pemetrexed,Pem)对人肺腺癌HCC827细胞株增殖抑制作用的影响以及对程序性死亡配体-1(programmed cell death-Ligand1,PD-L1)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路相关蛋白AKT、p-AKT表达的影响,并进一步探索其可能的作用机制。
方法:(1)HCC827肿瘤细胞的培养:把HCC827肺癌细胞培养在含有10%胎牛血清的1640培养基里,然后放在含有5%CO2、37℃恒温、饱和湿度的培养箱里,采用处于对数期的肿瘤细胞作为后续实验的实验细胞。(2)取用浓度依次为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L的培美曲塞分别处理HCC827细胞12、24、48h,CCK-8法检测细胞的增殖抑制作用及确定培美曲塞的半数抑制浓度(IC50),同时选最佳作用时间(48h)作为后续实验的干预时间,并将该时间时对应的培美曲塞的IC50作为后续实验里的药物浓度。(3)采用流式细胞仪检测不同浓度的培美曲塞(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)作用于细胞48h后PD-L1的表达情况,并行统计学计算处理,用以比较各组间的差异。(4)实验分组和处理:把实验分成4组,依次为对照组(添加培养液)、IC50培美曲塞组、PI3K/AKT通路激活剂740Y-P组、IC50培美曲塞+740Y-P组。(5)蛋白免疫印记杂交法(Western Blot)检测各组AKT、p-AKT蛋白表达情况:按照方法(4)的分组,处理细胞48h后使用Western Blot测定各组AKT、p-AKT蛋白表达情况,并对各组间差异进行比较。(6)流式细胞仪检测各组PD-L1表达水平:按照上述分组情况,处理细胞48h后使用流式细胞仪检测各组PD-L1表达水平,同时对各组PD-L1表达差异进行比较。
结果:(1)CCK-8法检测培美曲塞对肿瘤细胞的增殖抑制作用:与对照组相比较,随着培美曲塞浓度的上升,抑制率逐渐增加(P<0.05),各组两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);培美曲塞48h组抑制作用强于12h组(P<0.05),与24h组抑制率无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05),选择48h作为后续实验时间,48h培美曲塞IC50值为0.171μmol/L;(2)流式细胞术检测不同浓度的培美曲塞对肿瘤细胞PD-L1表达的影响:随着培美曲塞浓度增加,各组细胞PD-L1表达逐渐下降(55.07±1.81、44.83±1.74、38.3±1.73、27.13±0.78、23.4±1.21、16.73±0.76),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);(3)Western Blot测定每一组的p-AKT、AKT表达变化情况:各组细胞被干预48h后,对照组、IC50Pem组、740Y-P组、IC50Pem+740Y-P组p-AKT蛋白表达水平分别为0.24±0.01、0.05±0.01、0.54±0.03、0.13±0.01;与对照组相比,740Y-P组的p-AKT蛋白表达水平升高(P<0.05),在IC50Pem组、IC50Pem+740Y-P联合组中表达降低(P<0.05),且IC50Pem组的p-AKT表达低于IC50Pem+740Y-P组(P<0.05)。各实验组AKT蛋白表达量依次为0.63±0.03、0.64±0.04、0.63±0.03、0.65±0.02,两两比较差异没有统计学意义(P>0.05);(4)流式细胞术检测各实验组PD-L1表达情况:作用于各组细胞48h后,PD-L1表达水平分别为59.83±2.58、32.5±1.04、71.63±2.82、41.1±2.48,与对照组相比,PD-L1表达量在740Y-P组上调(P<0.05),在IC50Pem组、IC50Pem+740Y-P组中表达量降低(P<0.05),且IC50Pem组的PD-L1表达量低于IC50Pem+740Y-P组,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:(1)培美曲塞可抑制HCC827细胞的活性与增殖能力,随着培美曲塞药物浓度的增加,细胞增殖能力逐步降低,且具有一定的浓度依赖性。(2)培美曲塞可下调p-AKT及PD-L1蛋白的表达。(3)培美曲塞下调HCC827细胞PD-L1的表达,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。
方法:(1)HCC827肿瘤细胞的培养:把HCC827肺癌细胞培养在含有10%胎牛血清的1640培养基里,然后放在含有5%CO2、37℃恒温、饱和湿度的培养箱里,采用处于对数期的肿瘤细胞作为后续实验的实验细胞。(2)取用浓度依次为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L的培美曲塞分别处理HCC827细胞12、24、48h,CCK-8法检测细胞的增殖抑制作用及确定培美曲塞的半数抑制浓度(IC50),同时选最佳作用时间(48h)作为后续实验的干预时间,并将该时间时对应的培美曲塞的IC50作为后续实验里的药物浓度。(3)采用流式细胞仪检测不同浓度的培美曲塞(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)作用于细胞48h后PD-L1的表达情况,并行统计学计算处理,用以比较各组间的差异。(4)实验分组和处理:把实验分成4组,依次为对照组(添加培养液)、IC50培美曲塞组、PI3K/AKT通路激活剂740Y-P组、IC50培美曲塞+740Y-P组。(5)蛋白免疫印记杂交法(Western Blot)检测各组AKT、p-AKT蛋白表达情况:按照方法(4)的分组,处理细胞48h后使用Western Blot测定各组AKT、p-AKT蛋白表达情况,并对各组间差异进行比较。(6)流式细胞仪检测各组PD-L1表达水平:按照上述分组情况,处理细胞48h后使用流式细胞仪检测各组PD-L1表达水平,同时对各组PD-L1表达差异进行比较。
结果:(1)CCK-8法检测培美曲塞对肿瘤细胞的增殖抑制作用:与对照组相比较,随着培美曲塞浓度的上升,抑制率逐渐增加(P<0.05),各组两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);培美曲塞48h组抑制作用强于12h组(P<0.05),与24h组抑制率无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05),选择48h作为后续实验时间,48h培美曲塞IC50值为0.171μmol/L;(2)流式细胞术检测不同浓度的培美曲塞对肿瘤细胞PD-L1表达的影响:随着培美曲塞浓度增加,各组细胞PD-L1表达逐渐下降(55.07±1.81、44.83±1.74、38.3±1.73、27.13±0.78、23.4±1.21、16.73±0.76),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);(3)Western Blot测定每一组的p-AKT、AKT表达变化情况:各组细胞被干预48h后,对照组、IC50Pem组、740Y-P组、IC50Pem+740Y-P组p-AKT蛋白表达水平分别为0.24±0.01、0.05±0.01、0.54±0.03、0.13±0.01;与对照组相比,740Y-P组的p-AKT蛋白表达水平升高(P<0.05),在IC50Pem组、IC50Pem+740Y-P联合组中表达降低(P<0.05),且IC50Pem组的p-AKT表达低于IC50Pem+740Y-P组(P<0.05)。各实验组AKT蛋白表达量依次为0.63±0.03、0.64±0.04、0.63±0.03、0.65±0.02,两两比较差异没有统计学意义(P>0.05);(4)流式细胞术检测各实验组PD-L1表达情况:作用于各组细胞48h后,PD-L1表达水平分别为59.83±2.58、32.5±1.04、71.63±2.82、41.1±2.48,与对照组相比,PD-L1表达量在740Y-P组上调(P<0.05),在IC50Pem组、IC50Pem+740Y-P组中表达量降低(P<0.05),且IC50Pem组的PD-L1表达量低于IC50Pem+740Y-P组,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:(1)培美曲塞可抑制HCC827细胞的活性与增殖能力,随着培美曲塞药物浓度的增加,细胞增殖能力逐步降低,且具有一定的浓度依赖性。(2)培美曲塞可下调p-AKT及PD-L1蛋白的表达。(3)培美曲塞下调HCC827细胞PD-L1的表达,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。