许氏平鲉模式识别受体TLR和NLR的鉴定及功能分析

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模式识别受体(PRR)包括跨膜蛋白Toll-like受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR),以及细胞质蛋白如Nod-like受体(NLR)、视黄酸诱导基因RIG-Ilike受体(RLR)和AIM样受体(ALR)等多种识别受体,是分布于免疫细胞的膜表面或膜内部,能够识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),介导先天免疫的固有免疫分子。目前对于硬骨鱼模式识别受体的鉴定已受到研究人员的广泛关注。其中,NLR、TLR等模式识别受体已经在斑马鱼、鲤、斑点叉尾鮰、牙鲆等多个硬骨鱼种类中得到鉴定,这些识别受体可以被多种配体激活,包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和聚肌苷-聚胞苷酸[Poly(I:C)]等,被激活的模式识别受体基因在鱼不同组织中产生差异表达,并调控免疫通路中其他关键分子的产生或凋亡。对模式识别受体的鉴定与研究为进一步研究关联免疫基因及信号通路奠定基础,为完善硬骨鱼的先天免疫机制提供了支撑。许氏平鲉(black rockfish,学名Sebastes schelgelii)是一种重要的经济鱼类,广泛分布于东亚沿海地区。随着养殖规模的扩大,各种病原菌威胁其生产,造成巨大的经济损失。对于许氏平鲉模式识别受体的研究有助于深入了解它们的免疫调节机制。然而,目前对于许氏平鲉中TLR和NLR两种模式识别受体还缺少系统性的研究。,因此,我们进行了这两个模式识别受体家族的鉴定及功能解析,主要研究方法与结果如下:(1)基于全基因组数据库鉴别了17个TLR基因。其中,TLR1、TLR2、TLR5和TLR13四个基因存在多拷贝现象,推测它们在进化过程中发生了串联复制事件;TLR2-3和TLR2-4的外显子与内含子的数量最多,各含有11个外显子,10个内含子。共线性分析表明,许氏平鲉TLR基因及相邻基因的排列方式与大黄鱼中的TLR基因类似,两个物种TLR基因表现出较强的共线性关系。系统发育树分析显示这些TLR基因分属5个亚家族。各亚家族基因的进化选择压力分析结果显示,TLR2-2、TLR2-3、TLR3、TLR9、TLR10和TLR13-2的Ka/Ks平均值均大于一,经历了纯化选择,其余14种TLR基因则经历了正向选择。同时,通过q RT-PCR研究了TLR基因在E.tarda感染后肠道中的表达模式,TLR3-1和TLR3-2两基因在刺激后的各时间点发生了显著上调,TLR5-1,TLR5-2,TLR5-3,TLR7,TLR8则在多个时间点显著下调,显示出TLR发生免疫应答后的表达特异性。最后,蛋白质间相互作用(PPI)网络分析表明,TLR基因与IFN诱导基因、炎症细胞因子相互作用,并参与My D88依赖性途径。(2)基于全基因组数据库,在许氏平鲉中鉴定了23个NLR基因。其中NLCC3基因有16个拷贝。通过系统发育分析将这些NLR基因划分为五个亚家族,并进行了基因和蛋白层面的生物信息学分析。通过分子钟推算进化选择压力结果表明,大多数NLR基因的Ka/Ks比值小于1,除了APAF1外,它们都经历了纯化选择。蛋白质间相互作用分析表明,NLR蛋白可能与caspase、ripk2和TRAF等免疫分子相互作用。健康组织中NLR的表达结果显示,超过一半NLR基因在皮肤中获得最高表达倍数,此外,NLR在肠道、脾脏、肾脏和肌肉中的表达量也普遍偏高。通过研究了迟发性爱德华氏菌感染后黏膜组织中NLR基因的表达模式,在感染后的肠道组织中,大部分NLR基因在感染后2小时时间点下调;感染后的鳃组织中,大多数基因在每个时间点都发生下调表达,而NLRC5和APAF1两个基因显示出特别的上调表达;感染后的皮肤组织中,NLRC3.2,NLRC3.8,NLRC3.11,NOD1,NOD2,NWD1六个基因在各个时间点均发生上调表达,相反的,NLRC3.5和NLRC3.9两个基因在各时间点均发生下调。此外,基于系统进化树以及分子钟标记估算出大约5-50MYA年之间,硬骨鱼类中的NLRC3或NLRC3-like基因发生了多次扩张。这些结果为了解许氏平鲉中NLR基因的免疫调节机制和功能提供了有价值的证据。
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