罗哌卡因是目前临床麻醉与疼痛治疗中常用局麻药之一,由于其对神经系统与心脏毒性低等优点,在儿科领域的应用日益增多。但因婴幼儿特殊的生理发育特点,其相对于成年人而言,更易发生局部麻醉药的急性全身毒性反应(Local Anesthetic Systemic Toxicity, LAST)即使在正常剂量下,LAST亦难以避免,尤以中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)与心血管系统毒性最为严重。CNS毒性惊厥或其持续状态可导致发育中的CNS结构与功能损害直接影响患儿生命安全和生存质量。婴幼儿的药物代谢系统的发育与成年人存在一定差异。酰胺类局部麻醉药(Local Anesthetics, LA)主要通过肝脏微粒体酶、酰胺酶分解,代谢产物主要经肾脏排出,仅有不到5%以原形从尿排出。而婴幼儿肝、肾器官功能的发育与体格生长平行,在整个小儿时期不断进行,但各年龄阶段生长发育的速度不同。年龄越小尤其新生儿,血浆蛋白(包括a-酸性糖蛋白、白蛋白、γ-球蛋白、脂蛋白等)含量低,结合药物能力差等因素都使游离型LA的比例较成人更高,继而LA毒性敏感性增加。婴幼儿的中枢神经系统发育与成年人亦存在不同程度的差异。出生时大脑已有全部主要的沟回,但皮层较薄,沟裂较浅；神经细胞数目已与成人相同,但树突与轴突少而短。出生后神经细胞体积逐渐增大和树突增多、加长,神经髓鞘的逐步形成和发育成热。3岁时神经细胞分化已基本完成,8岁时接近成人而神经纤维髓鞘化到4岁时才完成。有研究指出,海马区齿状回(DG)区域的神经发生现象(即新生细胞分化为成熟神经元的再生能力)与年龄明显相关,年龄越小,再生能力越强。故婴幼儿CNS发育成熟度以及神经细胞再生能力均可能直接影响LAST的严重程度和预后。LA毒性惊厥发生时,大脑皮层抑制通路受阻滞,引起CNS相对兴奋,神经元释放兴奋性氨基酸增多,N-甲基-D-天冬氨酸受体过度兴奋,导致神经元内Ca2+超载,一氧化氮生成增加,继而可能造成海马区细胞结构与功能损害。目前检测细胞凋亡表达常用凋亡因子(Bax)与抑凋亡因子(Bcl-2)阳性细胞核数目的表达及两者比值。组织缺血时Bax转录并与Bcl-2竞争线粒体膜通道受体诱发线粒体释放细胞色素C至胞质,细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子(APAF-1)和dATP结合又激活Caspase-3使DNA多聚酶裂解,促使凋亡发生。Bcl-2和Bax相互竞争,间接调节蛋白酶和核酸酶活性,从而双相调节细胞凋亡。有文献指出,惊厥可造成CNS海马区细胞结构损害,继而对海马依赖性的学习记忆功能产生一定影响。而哺乳动物发育期是认知学习能力形成的关键时期,在这关键期内罗哌卡因毒性惊厥致发育期CNS海马区细胞Bax与Bcl-2阳性细胞核数目表达及两者比值失衡,可造成海马区结构损害,继而影响其依赖性的学习记忆功能。目前研究鼠类的空间学习记忆能力常根据其在Morris水迷宫(Morris Water Maze, MWM)实验中的表现进行评估。定位航行实验和空间搜索实验是MWM最基本的实验,实验训练的空间学习记忆属于联合型学习,平台的位置与大鼠自身所处的位置无关,是一种以异我为参考点的参考认知,所形成的记忆是空间参考记忆。其完成空间学习和记忆任务时,意识的存储与提取涉及包括海马在内的大量脑区和神经传导路径。目前关于LAST导致成人CNS结构和功能的损害的研究报道甚少,而迄今为止,关于LA对婴幼儿发育中的CNS毒性尤其对海马区神经细胞毒性的研究,笔者尚未发现相关文献报道。本研究以不同发育期的SD大鼠为研究对象,应用序贯法测定不同发育期SD大鼠罗哌卡因毒性惊厥的半数有效量(ED50),继而建立罗哌卡因毒性惊厥模型,检测海马区细胞凋亡因子(Bax)与抑凋亡因子(Bcl-2)在惊厥后不同时间点的表达及两者的比值,以及应用Morris水迷宫检测惊厥近期和远期的惊厥大鼠学习记忆能力。本研究主要探讨以下几个问题：①罗哌卡因惊厥ED50致单次毒性惊厥对海马区神经细胞是否会造成结构与功能的损害?②损害是否可逆?③损害是否存在日龄差异性?第一部分序贯法测定不同发育期大鼠罗哌卡因毒性惊厥ED5o1材料和方法1.1实验动物分组清洁级健康SD大鼠44只,雌雄不限,按日龄分成两组：15日龄组(D15)和60日龄组(D60),每组22只。实验前先置实验动物中心实验室饲养1d,自由摄食摄水。1.2实验药品1.0%盐酸罗哌卡因注射液(阿斯利康药品有限公司生产,批号：DL670),0.9%氯化钠溶液(由南方医科大学珠江医院提供)1.3实验方法用生理盐水稀释罗哌卡因液,配成0.5%盐酸罗哌卡因溶液。根据相关文献资料和预实验结果,以剂量的对数差为±0.05的等比数列剂量(即)15组采用44.67mg/kg,50.12mmg/kg,56.23mg/kg,63.10mg/kg,68.72mg/kg的剂量组,D60组采用28.16mg/kg,31.62mg/kg,35.48mg/kg,39.81mg/kg,44.67mg/kg的剂量组),按序贯法要求将各组大鼠依次腹腔注射相应剂量罗哌卡因溶液。注药30min内仔细观测大鼠是否发生惊厥。由上一只大鼠实验结果决定下一只大鼠注射的剂量。根据序贯法的相关公式计算其惊厥ED50惊厥标准的判断：按Racine分级法,0级为：无惊厥发生；Ⅰ级：面部抽搐；Ⅱ级：点头；Ⅲ级：前肢阵挛抽搐；Ⅳ级：全身强直；Ⅴ级：全身强直阵挛。此实验若大鼠给药30mi n内惊厥发作达到Ⅲ级(含Ⅲ级)以上者记录为阳性(+)；未发生惊厥则记录之为阴性(一)。1.4统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示,根据Brownlee上下序贯法计算公式计算两组罗哌卡因致惊厥的ED50,及其95%的可信区间。两组lgED50匕较采用两样本t检验,F<0.05认为差异有统计学意义。2结果实验对象D15组大鼠体重24.7±2.1g,D60组大鼠体重173.8±4.3g,无一例腹腔注射回抽有血。所有惊厥幼鼠均在注药后30min内发作。15日龄大鼠罗哌卡因惊厥ED50是54.95mg/kg,其95%的可信区间是50.52mg/kg-59.77mg/kg；60日龄大鼠罗哌卡因惊厥ED50是34.36mg/kg,其95%的可信区间是31.81mg/k～37.11mg/kg。两组IgED50差别有显著统计学意义。3结论3.1运用序贯法测算大鼠罗哌卡因惊厥ED50简便、快速、有效。3.215日龄大鼠罗哌卡因惊厥ED50为54.95mg/kg；60日龄大鼠罗哌卡因惊厥ED50为34.36mg/kg。大鼠罗哌卡因毒性惊厥FD50存在一定的日龄差异性：日龄越小其惊厥ED50值越大。第二部分罗哌卡因毒性惊厥对不同发育期大鼠海马细胞Bax、Bcl-2表达及其两者比值的影响1材料与方法1.1实验动物准备SPF级健康SD大鼠194只,雌雄不限,按日龄分成两组：15日龄组(D15)和60日龄组(D60),每组97只。同日龄组内大鼠分别随机分配到生理盐水组(NS组,n=35)和罗哌卡因组(n=62)1.2主要试剂与仪器1.0%盐酸罗哌卡因注射液(阿斯利康药品有限公司生产,批号：DL670)；Bax(p-19)(美国Sana Cruz公司)稀释度为1：200,二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG；Bcl-2(N-19)兔抗鼠多抗(美国Santa Cruz公司)稀释度为1：100,二抗为生物素标记的羊抗兔IgG；二抗SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BX41荧光成像系统显微镜为奥林巴斯生产；Iamge-ProPuls6.0多功能彩色病例图像分析系统(版本6.0)为Media Cybernetics, Inc开发；PM-8000Express便携式多参数监护仪由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产。1.3惊厥模型的制作根据第一部分实验结果,罗哌卡因组分别腹腔注射其相应日龄惊厥ED50,的0.5%罗哌卡因溶液(即15日龄大鼠为54.95mg/Kg,60日龄大鼠为34.36mg/Kg),其生理盐水组腹腔注射相应容量的生理盐水,并置于30%的氧气环境中密切观察大鼠的惊厥行为变化和皮肤颜色有无紫绀表现。罗哌卡因组大鼠在惊厥期间用婴儿脉搏血氧饱和度探头贴于大鼠腹部,监测血氧饱和度(Sp02)和心率(HR)。若给药30min内大鼠惊厥发作达到Racine分级Ⅲ级(含Ⅲ级)以上,视为惊厥发作开始,造模成功；若惊厥发作为Racine分级0级且翻正反射恢复,视为惊厥发作停止。如惊厥持续发作超过20min,给予腹腔注射10%水合氯醛350mmg/kg控制惊厥。成功造模的罗哌卡因组标记为惊厥组(SC组)。若惊厥时SpO2低于90%超过1min、惊厥持续发作超过30min或死亡者视为造模失败。由造模失败导致各惊厥组样本量不足35只,则按随机原则补足。1.4Bax和Bcl-2蛋白免疫组化检测15日龄和60日龄的惊厥组大鼠分别于惊厥发作停止后2h、6h、24h、3d、7d各取5只,依次麻醉后开胸,主动脉灌注固定后,留取带有海马组织块,石蜡包埋,切片,免疫组织化学实验严格按照说明书进行。15日龄和60日龄的生理盐水组在上述各时点各取5只做上述处理。在显微镜下(×400)观察每张切片海马区单位面积内Bax和Bcl-2阳性细胞核数目的表达,作为该时间点的阳性细胞数,并计算其两者比值。1.5统计学处理数据用SPSS13.0统计学软件处理,计量资料数据采用均数±标准差(x±s)表示,各惊厥组惊厥反应一般情况采用两样本t检验,不同年龄组在不同时间点Bax与Bcl-2阳性细胞核表达数目的比较采用析因设计资料方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1罗哌卡因腹腔注射后大鼠的一般情况和SpO2的变化在整个实验过程中,在进入惊厥发作前,所有大鼠呼吸平稳,皮肤颜色均呈粉红色,未发现有紫绀情况。15日龄的幼鼠惊厥的潜伏期(15.800±7.116s)和持续时间(19.400±6.006s)较长,惊厥多为Ⅲ级～Ⅳ级；而60日龄的幼鼠惊厥潜伏期(9.260±3.721s)和持续时间(7.230±4.615s)较短,惊厥多为Ⅳ级～Ⅴ级。惊厥停止后,惊厥组均能正常觅食饮水,活动。惊厥组大鼠惊厥发作前SpO2维持在97%-100%,惊厥发作时SpO2维持在90%以上,发作停止后恢复到惊厥前水平。2.2海马区Bax和Bcl2阳性细胞核表达15日龄和60日龄的生理盐水组在各个时点海马区单位面积内Bax和Bcl-2表达阳性细胞核的数目保持相对平稳,呈低水平表达。惊厥组海马区单位面积内Bax与Bcl-2表达阳性细胞核的数目在惊厥后2h时开始升高,惊厥后6h升高明显,惊厥后24h达到高峰后逐渐回落。15日龄的惊厥组海马区细胞单位面积内Bax与Bcl-2表达阳性细胞核的数目在惊厥后7d与同日龄生理盐水组比较差异无统计学意义。60日龄的惊厥组海马区细胞单位面积内Bax表达阳性细胞核的数目在惊厥后7d仍明显高于同日龄生理盐水组；Bcl-2阳性细胞核数目则在惊厥后7d与同日龄的生理盐水组比较差异无统计学意义。2.3海马区Bax/Bcl-2的比值15日龄和60日龄的生理盐水组海马区Bax/Bcl-2比值在各个时点保持相对平稳,约在1.00～1.05之间。与生理盐水组相比,15日龄和60日龄的惊厥组在惊厥早期Bax/Bcl-2比值均有明显的增加,尤以60日龄的升高明显；在惊厥后期Bax/Bcl-2比值逐渐下降,其中15日龄惊厥组在惊厥后3d降至同日龄生理盐水组水平,60日龄惊厥组惊厥后3d与7d均高于同日龄生理盐水组水平3结论3.1正常大鼠海马区细胞单位面积内表达Bax与Bcl-2阳性细胞核的数目及其两者比值相对平稳,呈低水平表达。3.2罗哌卡因惊厥ED50致单次惊厥对大鼠海马区细胞单位面积内表达Bax与Bcl-2阳性细胞核的数目及其两者比值的影响存在一定日龄差异性。日龄越小,单位面积内表达Bax与Bcl-2阳性细胞核的数目及其两者比值失衡时间越短。第三部分罗哌卡因毒性惊厥对不同发育期大鼠学习记忆的影响1材料与方法1.1实验动物的准备实验动物模型由第二部分实验提供,随机选取15日龄与60日龄的惊厥组和生理盐水组大鼠各10只,共40只。实验均安排在下午进行。实验开始前30min将小鼠置水迷宫所在实验室以适应环境。1.2实验主要设备Morris水迷宫为按文献定制的直径120cm不锈钢圆形水池,高50cm。实验时,水深21cm,将一直径9cm、透明的圆形铁制平台固定于某一象限,平台低于水面0.8cm,用数码摄像机以全程(跟踪)摄像方式,实验数据由相关软件分析记录。1.3Morris水迷宫定位航行实验与空间探索实验各组大鼠从惊厥后第8d开始,先学习训练3d,每天下午训练4次,分别从4个象限的池壁中点为入水点,实验者将小鼠以手托起令其面向池壁,轻轻放入水中。小鼠在120s内能寻找到平台,则记录其搜寻并登上平台所需要的时间,即逃避潜伏期(escape latency, EL)。若小鼠在120s内未能找到平台,则由实验者用手将其引导至平台,逃避潜伏期记为120s。小鼠登上平台后,让其在平台上停留30s。第4d开始连续3d下午进行定位航行能力测试。固定以最远离平台象限的池壁中点为入水点,记录EL值；第7d下午撤除水下平台,从远离原平台最远的象限入水后60s内计算大鼠跨越平台位点的次数(crossing times, CT)。各组受试大鼠完成上述测试后,置实验动物中心实验室饲养38d。第39d起(即惊厥后45d)再连续3d下午进行Morris水迷宫定位航行能力测试,计算其EL值。第43d(即惊厥后49d)进行Morris水迷宫空间探索实验,计算其CT值。1.4统计学处理数据用SPSS13.0统计学软件处理,计量资料数据采用均数±标准差(x±s)表示,水迷宫重复测量数据行重复测量设计资料的方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1惊厥近期Morris水迷宫定位航行和空间探索实验随着训练的天数增加,各组大鼠EL平均值逐渐减少。与15日龄生理盐水组比较,15日龄惊厥组各天的EL和CT平均值差异均无统计学意义(P﹥0.05)：与60日龄生理盐水组比较,60日龄惊厥组各天的EL平均值明显延长,CT平均值明显减少,差别有统计学意义(P<0.05)。2.2惊厥远期Morris水迷宫定位航行和空间探索实验随着天数增加,各组大鼠EL平均值逐渐减少。与惊厥近期的测试结果比较,各组大鼠定位航行的成绩均有提高。与同日龄生理盐水组比较,各日龄惊厥组各天的EL和CT平均值差异均无统计学意义(P﹥0.05)。3结论3.1在惊厥近期,罗哌卡因惊厥ED50致单次惊厥对大鼠学习记忆功能影响有明显日龄差异性：15日龄大鼠无明显影响,而60日龄大鼠则有一定程度的损害。3.2在惊厥远期,由罗哌卡因惊厥ED50致单次毒性惊厥对大鼠学习记忆功能无明显影响,且无明显日龄差异性。第四部分全文结论4.115日龄大鼠罗哌卡因惊厥ED50是54.95mmg/kg；60日龄大鼠罗哌卡因惊厥ED50是34.36mg/kg。实验提示大鼠罗哌卡因惊厥ED50存在一定的日龄差异性。日龄越小,其惊厥ED50值越大。4.2罗哌卡因惊厥ED50致单次惊厥对大鼠海马区神经细胞单位面积Bax与Bcl-2阳性细胞核数目的表达及两者比值的影响存在一定日龄差异性。日龄越小,单位面积Bax与Bcl-2阳性细胞核数目的表达及两者比值失衡时间越短。4.3在惊厥近期,罗哌卡因惊厥ED50致单次毒性惊厥对大鼠学习记忆功能影响有明显日龄差异性：15日龄大鼠无明显影响,而60日龄大鼠学习记忆功能则有一定程度的损害4.4在惊厥远期,由罗哌卡因惊厥ED50致单次毒性惊厥对大鼠学习记忆功能无明显影响,且无明显日龄差异性。