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氯过氧化物酶(Chloroperoxidase,CPO)因其独特的活性位点结构而具有卤化、醇氧化、羟基化、环氧化、磺化氧化等多种多样的催化活性,并且对底物具有手性识别功能和广泛的底物适应性,因此在现代合成化学、医药工业和环境生物催化中具有很大的应用潜力。但在合成反应体系中,常使用酸、碱和有机溶剂,反应温度也较高,在这样的极端条件下,CPO易变性失活,使其实际应用受到很大限制。所以研究基于特定底物对CPO失活和激活的机理,以研究提高极端条件下CPO稳定性的途径,建立CPO的稳定化平台,这是开发其应用潜能的前提。本文采用非共价修饰—添加剂法,以CPO催化氧化吲哚生成氧化吲哚为模型反应,研究了在各种温度下,葡萄糖、果糖、树胶醛糖、半乳糖、海藻糖、葡聚糖、木糖、聚乙二醇200(PEG200)、二-2(-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)等添加剂对CPO的稳定性和活性的影响。结果发现,在25℃时,表面活性剂AOT能使CPO的活性提高25%,在观察的882 h内保持不变,而且能有效增加有机底物的溶解度;PEG200和甘油在25℃-60℃温度范围内是有效的添加剂,特别是在50℃时,它们能把CPO的稳定性从10 h延长到200 h以上。在40℃,50℃,60℃海藻糖存在时,CPO的稳定性也分别被延长了2.6,7,2.5倍。文中对这几种添加剂的保护机理进行了初步讨论。本文还进一步研究了葡萄糖导致的CPO失活。实验中发现在葡萄糖存在时,棕红色的CPO能快速的转化为绿色,同时CPO在398 nm处的特征吸收峰逐渐消失,而且这种绿色CPO非常稳定。葡萄糖致使CPO失活的现象为首次报道。因此本文采用紫外可见吸收光谱、荧光光谱和激光拉曼光谱等谱学方法进一步研究了葡萄糖与氯过氧化物酶(CPO)的相互作用,并和肌红蛋白(Mb)、辣根过氧化物酶(HRP)、细胞色素P450等血红素过氧化物酶及氯化血红素与葡萄糖的相互作用进行比较,结果发现在葡萄糖存在时只有CPO活性降低甚至完全丧失。本文基于实验事实对葡萄糖导致CPO失活的机理进行了推测:由于血红素铁第六配位点可接纳其他功能配体,葡萄糖进入CPO的活性中心后,其羟基氧作为电子给体和CPO活性中心的卟啉铁发生部分配位,使卟啉环的结构发生扭曲,非平面性增加,从而导致CPO失活。这可能由两个原因导致:(1)CPO的活性位点更向卟啉环开放。CPO的远端酸碱催化成分是亲水性的谷氨酸,而P450等其它血红素过氧化物酶的相应部位是疏水性的组氨酸。谷氨酸的碱性强于组氨酸,有利于增强葡萄糖上—OH的电子云密度,强化其给电子效应,因而有利于葡萄糖和CPO活性中心卟啉环上的铁发生配位。(2)CPO晶体结构研究显示在CPO活性中心卟啉环的上方存在一个通道,底物可以利用这个通道接近活性中心,这个通道是可调节的,具有立体选择性。葡萄糖与半乳糖相比其构象不同:半乳糖的四个—OH为1a2a3a4a,而葡萄糖是1a2a3a4e;同时与六元醛糖的葡萄糖相比,木糖是五元酮糖。实验结果表明葡萄糖与通道的立体选择性最为匹配,因此葡萄糖使CPO失活的现象最显著。同时研究还发现SHCH2COOH的加入可使CPO的活性提高23.7%。这是由于SHCH2COOH能够提高CPO中心铁离子的电荷密度,进而有利于将电子给予H2O2中氧的反键轨道,促进O-O键断裂,容易生成含FeⅣ=O的中间体化合物I,最终达到提高CPO活性的目的。