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研究背景和研究目的上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是上皮细胞在特定的生理和(或)病理情况下,转化至间质细胞形态并获得间质特性的现象。在此过程中,细胞极性消失、细胞间紧密连接和黏附连接消失,同时产生了新的细胞外基质成分,细胞获得了迁移能力及分化能力。EMT广泛存在于生物体生长发育的各阶段,是胚胎分化成熟、组织器官损伤修复及肿瘤转移中的重要环节。在病毒性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝等病理状态下,成熟肝脏中的肝细胞会发生损伤甚至死亡,此时,EMT参与组织的修复,促进细胞转化,并迁移至受损区域,填补缺损并完成受损组织的再生。但当刺激因素持续存在或损伤程度超过修复能力时,EMT在不完全修复过程中会加剧肝纤维化的发生,并最终导致肝硬化。而在肝细胞癌(Hepatocelullar carcinoma, HCC)中,EMT使肝癌细胞摆脱细胞间连接,出现侵袭性,促进转移和增殖,最终会引起HCC转移、复发,影响病人预后。HCC是我国常见的恶性肿瘤之一,位列肿瘤发病率第六位,肿瘤致死率第三位。虽然手术技术及医药水平不断提高,但远期预后差的问题未能从根本上得到改变。肝内转移及治疗后高复发率仍是影响肝癌的治疗及预后的重要因素,即使在直径<5cm的早期HCC病人中,也有近60%出现肝内转移,而出现肝内转移的病人手术切除后1年生存率不到40%。针对这一问题寻找有效的治疗靶点和特异性的标志物成为研究的重点之一。EMT是一个复杂的生物学过程,目前发现肿瘤微环境、生长因子、转录因子、微小RNA (microRNA, miRNA)等诸多因素参与调控EMT。转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)、表皮生长因子(epidermal growthfactor, EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等生长因子、信号通路相互作用,诱导或激活EMT相关的转录因子,如Snail1、Snail2、Twist、ZEB1、ZEB2等。使角蛋白、E-钙粘蛋白等表达下调,而波形蛋白、N-钙粘蛋白表达发生上调,最终细胞失去上皮表型出现间质特征。在其中,位于细胞膜的锌转运体LIV-1除调节细胞内Zn2+浓度外,还具有信息传递功能,参与多种信号调节,在EMT过程中与Snail1入核及表达相关,而后者可以进一步激活ZEB2,与E-cad的编码E-box区结合,抑制其表达,促进EMT进展。在多种恶性肿瘤的发生发展过程中,LIV-1、ZEB2均被证实与预后呈负相关,过表达影响预后。miRNA是一类具有基因调节功能的内源性非编码小分子RNA,可以通过识别3’-非编码区(3’-uncoding region,3’UTR)与靶mRNA结合,降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译,降低蛋白水平。近年来,有关miRNA的研究证实其参与调控多种肝脏疾病,而在EMT的过程中,miRNA也有重要意义。miRNA-192是在肝脏富集的一类miRNA,与p53的激活相关,参与细胞周期调控。研究证实在多种器官中,miRNA-192与纤维化过程中的EMT现象有关。我们通过生物学分析软件发现miRNA-192-5p与锌转运体蛋白LIV-1、锌指结合子增强蛋白ZEB2 mRNA的3’UTR端存在结合区,可能通过调控这两种因子影响HCC的EMT过程。本研究拟针对HCC中,niRNA-192-5p可能起到的调节作用开展相关实验,揭示其在EMT中作用的分子机制。研究方法1. RT-PCR检测肝癌细胞系与肝细胞系中靶蛋白基因转录水平；2. TargetScan数据库分析,预测可能作用于靶基因mRNA 3’UTR序列的miRNA;3.肝癌细胞系转染miRNA-192-5p mimics、inhibitor;4. RT-PCR检测转染后细胞中靶基因mRNA水平；5. Western blot检测靶蛋白表达水平;6. Western blot检测E-cadherin 水平;7. Transwell法检测细胞转染后迁移、侵袭能力变化；8.通过皮下注射肝癌细胞方式构建裸鼠肝癌细胞种植瘤模型；9.模型构建成功后每隔两天瘤内注射miRNA agomir,持续注射两周,定期观察小鼠生存情况和肿瘤生长情况收集移植瘤样本,至观察终点,处死实验动物,瘤组织做HE染色、免疫组织化学观察肿瘤细胞形态及靶蛋白表达情况；10.构建双荧光素酶报告载体,与miRNA-192-5p mimics共转染293T细胞,检测miRNA对靶基因mRNA 3’UTR作用。结果1.生物信息学分析显示,miRNA-192-5p与LIV-1、ZEB2 mRNA的3’UTR端序列片段有可能结合位点,表明miRNA-192-5p可能参与调控LIV-1、ZEB2的转录；2.在肝癌细胞中,LIV-1、ZEB2 mRNA水平高于正常肝细胞系,在HCC中高表达；3. miRNA-192-5p可以调控EMT中重要分子LIV-1、ZEB2;3.1.外源性转染miRNA-192-5p mimics后,LIV-1、ZEB2 mRNA水平下调；3.2.外源性转染miRNA-192-5p inhibitor后,LIV-1、ZEB2 mRNA水平上调；3.3.转染miRNA-192-5p mimics及inhibitor后,LIV-1、ZEB2蛋白水平变化与mRNA变化趋势相同;4.转染miRNA-192-5p mimics后,EMT中关键分子E-cadherin上调；5.转染miRNA-192-5p mimics后,肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H细胞迁移、侵袭能力减弱；6.裸鼠肝细胞癌种植瘤给予miRNA agomir注射后,肿瘤直径和体积无显著差异；7.HE染色显示,注射niRNA agomir 2周后,瘤内出现坏死区域；8.免疫组织化学染色显示,与对照组相比,LIV-1、ZEB2受抑制,E-cad、Ki67升高：9.双荧光素酶报告基因检测结果显示,miRNA-192-5p可以与ZEB2mRNA的3’UTR片段特异性结合；与LIV-1 mRNA的3’UTR片段未结合。结论本研究以生物信息学分析结果为基础,探讨上皮间质转化发生的可能机制,研究肝细胞癌发生发展过程中,miRNA-192-5p对上皮间质转化中重要分子的作用和调节机制,并拟通过体内及体外实验进行验证。得到以下结论：1.在肝癌细胞系中,EMT重要分子LIV-1、ZEB2水平上调；2. miRNA-192-5p参与肝细胞癌上皮间质转化调控的可能机制为,通过抑制LIV-1、ZEB2,上调E-cadherin,;3. miRNA-192-5p可能参与上皮间质转化调控,降低肝癌细胞迁移、侵袭能力；4. miRNA-192-5p作用机制为靶向作用于上皮间质转化中关键分子ZEB2mRNA的3’UTR,抑制ZEB2水平,同时可降低LIV-1水平。5. miRNA-192-5p在肝细胞癌移植瘤中还可影响细胞周期调控；在肝细胞癌中,上皮间质转化可以促进肿瘤细胞出现转移而影响病人预后。miRNA-192-5p作为上皮间质转化过程中关键分子ZEB2、LIV-1的调控因子,可以抑制LIV-1和ZEB2的表达,保护细胞间粘附蛋白,降低肿瘤细胞侵袭、迁移能力,抑制上皮间质转化。