【摘 要】
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目的:研究大肠杆菌可溶性表达的重组人角质细胞生长因子-I型N端缺失23个氨基酸后的突变体(△N23KGF-I,简称△K23)的聚乙二醇修饰、纯化工艺及其体内外生物活性。 方法:(1)
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目的:研究大肠杆菌可溶性表达的重组人角质细胞生长因子-I型N端缺失23个氨基酸后的突变体(△N23KGF-I,简称△K23)的聚乙二醇修饰、纯化工艺及其体内外生物活性。 方法:(1)破菌,SP sepharose F.F纯化,复性和Heparin sepharose F.F纯化得到突变体纯品;(2)用mPEG-马来酰亚胺修饰截短重组人角质细胞生长因子-I(△K23)的游离巯基,然后胰蛋白酶酶切,采用液质联用技术,获得质量肽图。对比单体及修饰后的蛋白还原质量肽图和非还原质量肽图,确定PEG的修饰位点;(3)通过NBL-7细胞、大鼠五氟尿嘧啶肠粘膜损伤模型进行体内外生物活性评价。 结果:获得的△K23单体的纯度能达到95％,工艺稳定;通过对修饰工艺的研究,得到了两个不同的修饰产物:mPEG-Mal-△K23-40(缩写:PEG-K23-40)、mPEG-Mal-△K23-102(缩写:PEG-K23-102)。前者修饰在Cys40位,后者修饰在Cys102位,100mg级△K23样品修饰后纯度达到95%以上,而且修饰位点单一。经体外的NBL-7的细胞测活,△K23和PEG-K23-40、PEG-K23-102的活性保留了以KGF-1国际标准品作为对照品的生物活性的98%,65%,30%。在大鼠的肠粘膜损伤修复实验中,△K23和PEG-K23-40相对于模型组有明显的效果,PEG-K23-102的效果则不明显。 结论:在非常规的PEG修饰条件下,首次成功的修饰了△N23KGF-I的两个半胱氨酸残基,并得到了高纯度,修饰位点单一的两种修饰产物:PEG-K23-40、PEG-K23-102。经体外活性的结果分析,PEG-K23-40初步证明有效,活性保留了65%。在体内活性方面,相对于模型组,PEG-K23-40也确实对粘膜损伤有修复作用,可以作为针对粘膜损伤的长效候选药物。在相同条件下,PEG-K23-102作用不明显,其其他的生物活性则有待研究。
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