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本文进行了如下研究:
一、SMR1的分离与纯化
通过对3株节旋藻原螺旋形藻丝、由螺旋形变直的藻丝,以及直线形回变成螺旋形的藻丝所作的蛋白质SDS-PAGE分析表明,螺旋形与直线形藻丝间至少存有5个差异蛋白,分别位于53.1, 52.0, 31.8, 21.9和20.31cDa处。以饨项节旋藻SP-S为材料,对其中差异较明显、位于21.9 ,cDa处的蛋白(SMR1)进行分离与纯化,主要步骤、技术参数与结果如下:(1)采用冻融法破碎节旋藻细胞,SMR1提取液的最佳pH为6.8; (2)硫酸铵分级沉降可有效去除杂蛋白,SMR1主要在硫酸铵饱和度为40-50%的级分中;(3)用Tris-HCl 缓冲液溶解硫酸铵沉降级分并依次经SephacrylS-200凝胶过滤层析, Q-Sepharose FF强阴离子交换层析后,制得了电泳纯的SMRI ,提取率约为祖提液总蛋白的0.065 % 。
二、SMR1的分子特征
纯化后SMR1的双向电泳分析显示,其纯度大于90%,等电点(PI)为4.93:色谱分析结果表明,SMR1的二级结构中。α-螺旋、β-折叠和无规卷曲的组成依次为31% 、12%和57%.同时,ES1-MS鉴定结果显示SMR1中有5条肽段、共53个氨基酸的序列与藻蓝蛋白连接多肽CpcI的高度一致,且分布于CpcI第3。一101位氨基酸残基内;N一端测序结果显示SMRI的N1一端序列与Cpcl的第30--44位氨基酸序列完全一致;MALDI-T0F MS测得SMR1的精确分子量为16712 Da.由上述结果推测SMR1很可能是一种由Cpcl基因表达并经修饰后形成、氨基酸序列与Cpcl中第30-171位一致的同源蛋白。考虑到不同藻株间 Cpcl基因的差异,应用PCR等技术从SP-S中克隆出cpcHID的操纵子并进行测序,进而根据SP-S中SMR1白勺核苷酸序列推导得其氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,根据SMR1氨基酸序列预测出来的分子量、等电点、二级结构等理论值与测得的实验值非常吻合,并可能由7个α-螺旋形成结构域,在节旋藻形态建成中行使其生物学功能。
三、SMR1的原核表达及抗体制备
由于从节旋藻中提取并分离纯化SMR1的得率低,难以满足抗体制备等实际需要。本研究应用转基因原核表达策略,通过对目的蛋白诱导温度与时间等表达条件优化,并应用镍亲和层析等分离技术获得了足量、电泳纯的SMR1产物。其中,所构建的表达质粒中目的蛋白诱导表达的适宜温度为摄氏25-30度 、时间为6-12小时。
同时,进一步以原核表达所获得的SMR1为抗原,通过免疫黑眼纯种新西兰兔制备抗体。共进行了4次免疫,每次免疫的蛋白量依次为1、0.5, 0.5和0.5mg。最后一次免疫结束两周后,颈动脉放血并收集血清。通过间接ELISA和Westcrn blot对所制抗体的特异性和效价等分析表明,效价高达1: 51200且均能与原核表达的SMR1,以及节旋藻中的SMR1发生免疫反应。这说明所制备SMR1抗体的效价高、特异性好,从而为进一步利用免疫共沉淀、蛋白质互作、蛋白质芯片等技术深入研究并揭示SMR1对节旋藻形态建成的生物功能与调控网络等奠定基础。