第一章同源性骨肉瘤细胞系ZOS和ZOS-M的建立和鉴定 目的:对来源于同一病人原发灶和跳跃转移灶两个骨肉瘤细胞系ZOS和ZOS-M生物学特性进行比较和鉴定。 方法: 组织块法培养来自原发灶和跳跃灶的骨肉瘤组织，获得两株细胞，分别命名为ZOS和ZOS-M。 利用光学显微镜和透射电镜对细胞的显微结构进行观察；G带染色法进行肿瘤细胞核型分析；台盼蓝活细胞染色法观察细胞的增殖特性；MTT法检测细胞对化疗药物氨甲喋呤、阿霉素和顺铂的敏感性；RT-PCR方法检测肿瘤细胞中骨钙素、骨桥蛋白和碱性磷酸酶等成骨性标志的表达。 利用基质胶侵袭实验比较两种细胞的体外侵袭能力。分别将肿瘤细胞注射至BALB/c-nu/nu裸鼠皮下、胫骨内和尾静脉，观察两种肿瘤细胞皮下、原位成瘤和实验性肺转移的能力。利用RT-PCR方法比较骨肉瘤成瘤和转移相关基因的表达。 结果: ZOS和ZOS-M通过手动刮除成纤维细胞获得纯化，体外增殖活跃，目前已经连续传代超过100代，生长稳定。镜下，细胞呈现聚集性生长，细胞形态不规则，核大，具有多个核分裂相等恶性特征。核型分析发现非整倍体染色体和多种染色体数目和结构异常。两种细胞的倍增时间分别为ZOS：33.65h，ZOS-M：31.58h。ZOS和ZOS-M均表达骨钙素，骨桥蛋白和碱性磷酸酶等成骨性标志基因。与传统的骨肉瘤细胞系U-2OS比较，ZOS和ZOSM对氨甲喋呤、阿霉素和顺铂的敏感性均较低。两种细胞皮下成瘤率和原位成瘤率均为100％，ZOS不能形成实验性肺转移，37.5％的裸鼠尾静脉注射ZOS-M后形成肺转移或骨转移。比较ZOS和ZOS-M转移相关基因表达，发现cadherin-11在ZOS-M中的低表达可能与其高侵袭能力相关。 结论: 1.ZOS和ZOS-M是两个新建成的骨肉瘤细胞系，具有100％皮下和原位成瘤率，是骨肉瘤研究的新模型。 2.ZOS和ZOS-M是从已经接受化疗的患者取材并建立的骨肉瘤细胞系，体外实验证明对当前的化疗药物敏感性差，因而是筛选骨肉瘤新药物的理想工具。 3.ZOS和ZOS-M分别来源于同一患者的原发灶和跳跃转移灶，体内外实验证明ZOS-M具有更强的侵袭能力，37.5％的接种裸鼠可以形成实验性肺转移或骨转移，因二者具有相同的遗传背景，所以对二者进行对比研究有助于揭示骨肉瘤转移发生机制。这是第一对未经长期体外筛选而获得的具有不同转移能力的同源性骨肉瘤细胞系。 4.ZOS-M中cadherin11低表达可能是促进其侵袭和转移的原因之一。 第二章骨肉瘤靶点基因的筛选 目的:比较骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞基因表达谱的差异，筛选具有诊断和治疗价值的靶点基因。 方法: 利用松质骨组织块培养法原代培养成骨细胞并检测其碱性磷酸酶表达和钙结节形成。常规培养骨肉瘤细胞株U-2OS、SaOS-2、ZOS、ZOS-M。提取骨肉瘤细胞和成骨细胞总RNA，进行纯化和鉴定，利用纯化的总RNA合成cRNA与AffymetrixU133plus2.0芯片杂交，经过洗脱染色之后，采用Affymetrix扫描仪进行扫描，GCOS1.2软件读取、处理数据。比较骨肉瘤细胞和成骨细胞基因表达差异，选取在骨肉瘤细胞株中共同高表达和低表达基因进一步验证。利用maltimeRT-PCR技术检测差异基因在骨肉瘤细胞系和临床标本中的表达。 结果: 原代培养的成骨细胞碱性磷酸酶阳性率为86％，长期培养可以形成钙结节。与两株原代培养成骨细胞比较，四株骨肉瘤细胞共有175个共同差异表达基因，29个上调表达基因，146个下调表达基因。其中MAGEA1，MAGEA2，MAGEA3，MAGEA12，CSAG2和PRAME等肿瘤-睾丸抗原基因表达显著升高。定量RT-PCR结果显示在骨肉瘤细胞系和肿瘤组织标本中上述基因表达明显高于正常成骨细胞。对MAGEA1，MAGEA2，MAGEA3，MAGEA12，CSAG2和PRAME在骨肉瘤组织中表达进行统计分析发现，以上六个基因在骨肉瘤组织中同步高表达，除CSAG2外，其它基因在软骨母细胞型骨肉瘤中表达高于骨母细胞型骨肉瘤。此外MAGE12在骨肉瘤中的表达水平与病人的年龄呈负相关，相关系数为-0.3949(p=0.038)。CT抗原基因表达与病人的性别和肿瘤分期无明显相关。146个下调基因涉及细胞增殖和凋亡、细胞黏附、细胞周期、细胞运动、免疫反应、信号转导、转录和翻译、代谢和运输等与肿瘤密切相关的过程。 结论: 1.骨肉瘤细胞株ZOS，ZOS-M，U-2OS，SaOS-2与两株原代培养成骨细胞相比，共同差异表达基因175个，其中共同上调29个，共同下调146个。 2.上调基因中最为显著的是肿瘤-睾丸抗原基因，包括MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA12、PRAME和CSAG2。RealtimeRT-PCR发现MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA12、PRAME和CSAG2在骨肉瘤组织中协同高表达，并且在软骨母细胞型骨肉瘤中表达高于骨母细胞型骨肉瘤。其中PRAME和CSAG2是新发现的在骨肉瘤中高频率表达的肿瘤抗原基因。 3.通过基因芯片的比较研究，发现了一批新的骨肉瘤相关基因，在以前的研究中未见报道，如PRG1、PERP、Meg3、FST、DLC1和IGFBP7等与肿瘤增殖和凋亡相关基因以及ADAMTS-1和POSTN等与成骨细胞分化和成熟相关基因等，为骨肉瘤研究提供了新的靶点。