背景：炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是指一组病因不明的非特异性肠道炎症,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD),主要发生在结肠黏模层的炎性病变,以溃疡糜烂为主,大部分会延伸影响到远端结肠和直肠,控制肠道黏膜屏障的炎症在溃疡性结肠炎病的临床治疗方面具有重要意义。该病临床常为慢性持续、反复发作,但个别也可急剧起病而呈暴发性。由于环境、个人生活习惯、饮食条件等变化,经统计该病显逐年增加的趋势。黏膜屏障是肠道最重要的一道屏障,由完整的肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell, IEC)和相邻肠上皮细胞之间的连接构成,调控着水和溶质的跨上皮转运(如单糖、氨基酸、核苷酸、维生素及激素等)。研究认为,黏膜上皮细胞及其细胞间的各种连接结构是肠道顾护外环境中有害物质或病原体入侵的关键,是维持肠上皮的选择通透性及其功能的结构基础。细胞间连接方式有多种,如紧密连接(Tight junction, TJ)、缝隙连接(Gap junction, GJ)、黏附连接(Adherence junction, AJ)以及桥粒(Desmosome)等,TJ是细胞间最重要的连接方式。肠上皮细胞(IEC)TJ一旦发生变异、减少或缺失,IEC的间隙通透性就会增加,细菌、内毒素及大分子物质即可通过TJ进入体循环。IBD特征就是IEC旁路通透性增高,允许肠腔内病原菌及其毒素通过并进入上皮下层,导致疾病的发生。因此,保护上皮屏障的紧密连接功能的完整性对防御与治疗炎症性肠病起着至关重要的作用。四君子汤(SiJunzi Decoction, SJZD)出自宋代《太平惠民和剂局方》,为益气健脾的代表方剂,临床常用于治疗脾虚证。多项临床研究使用四君子汤单方、加减方或配合其他药物治疗溃疡性结肠炎,疗效显著。课题组前期研究结果四君子汤可促进小肠上皮细胞增殖、迁移与抑制凋亡,具有修复胃肠道受损黏膜与免疫调节的作用。由此,我们提出工作假设：四君子汤治疗UC可能与影响肠道上皮紧密连接(TJ)蛋白表达有关。目的：建立大鼠实验性溃疡性结肠炎(UC)模型,以及体外肠道上皮屏障受损细胞模型,考察SJZD对肠道紧密连接蛋白表达的影响,探讨SJZD通过影响紧密连接蛋白表达,修复肠道黏膜屏障,治疗UC大鼠的分子机制,及其对NF-κB信号通路蛋白表达的影响。方法：体内实验：1.TNBS诱导的SD大鼠UC模型建立将动物称重编号后,随机区组法分为正常组(n=6)、TNBS 50mg/kg(n=6)组、TNBS 100mg/kg(n=6)组、TNBS 150mg/kg(n=6)组。造模24h后,每天灌胃给予无菌水一次(10mL/kg),观察大鼠体重、饮食、精神状态和粪便情况,给予DAI评分,连续10天。取大鼠血清和结肠,给予CMDI评分,并取病变结肠做病理切片HE染色进行观察,给予TDI评分,综合选取合适的造模条件。2.四君子汤对UC大鼠的治疗效果观察于造模后第二天开始灌胃给予四君子汤,实验设正常组、TNBS造模组、SASP阳性对照组、四君子汤复方给药组(含低、中、高剂量)10天。观察大鼠饮食、精神状态、体重、大便性状与隐血评分、大便次数与重量等情况,给予DAI评分。末次给药后禁食24h,腹主动脉收集大鼠血清。处死动物取结肠部分,肉眼观察结肠黏膜的病变并进行结肠大体形态损伤评分(CMDI),取病变部位进行HE染色,光镜下评价黏膜病理学损伤指数(TDI),分析四君子汤对TNBS诱导的SD大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用情况。3.四君子汤对UC大鼠结肠紧密连接mRNA和蛋白表达的影响采用RT-PCR法检测大鼠病变结肠组织紧密连接蛋白occludin、claudin-2基因表达,并采用免疫组化法分析大鼠结肠中紧密连接蛋白occludin、claudin-2的表达影响,计算各组平均光密度。4.四君子汤对UC大鼠结肠炎症因子mRNA表达与血清中炎症因子分泌的影响采用Real-Time PCR法检测四君子汤治疗后大鼠结肠中炎症因子IL-6, TNF-α、 IFN-γ、IL-1βmRNA表达,并使用Elisa法检测大鼠血清中IL-6、TNF-a、FN-γ、IL-1β、小肠三叶肽TFF-3的含量。体外实验：1.TNBS诱导的人结肠癌Caco-2细胞损伤模型建立使用不同浓度TNBS溶液(200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)损伤Caco-2细胞不同时间(4h、6h、12h、24h、48h)制作Caco-2细胞炎症模型,MTT法检测细胞活力,确定合适的TNBS造模浓度与损伤时间。2. SJZD总多糖中的多糖含量测定与简单质量控制使用硫酸苯酚法测定SJZD总多糖中多糖的含量,并对SJZD总多糖的稳定性进行考察。另外,采用BCA法检测了总多糖中蛋白质的含量。3. SJZD总多糖对Caco-2损伤模型的生长保护作用细胞经TNBS损伤造模之后,给予不同浓度SJZD总多糖(70μg/mL-200μg/mL)治疗,给药不同时间(24h、36h、48h),MTT法检测细胞活力,评价SJZD总多糖最佳给药浓度。4.四君子汤总多糖对TNBS损伤Caco-2细胞紧密连接蛋白的影响实验设正常组、模型组、总多糖给药组,同时设定不同给药时间(包括24h、 36h、48h), RT-PCR法检测紧密连接蛋白claudin-1,2,4、ZO-1,2,3、occludin、E-cad、 JAMmRNA的表达,并采用Western-blot法检测claudin-1、occludin与ZO-3,蛋白表达的情况。5.四君子汤总多糖对TNBS损伤Caco-2细胞NF-κB通路的影响实验分正常组、模型组、总多糖给药组,给药时间设6、9、12h。提取给药后的细胞核蛋白,分别使用NF-κB p50/p65 Tanscription Factor Assay Kit和 Western-Blot法检测核蛋白中NF-κB的表达。结果：体内实验：1.50mg/kg-150mg/kg TNBS均可诱导SD大鼠结肠出现黏膜损伤,制备出溃疡性结肠炎病理模型,模型可持续10天以上,其中以TNBS 100mg/kg、150mg/kg的结肠损伤作用更加显著。从模型稳定性与造模成本等因素上考虑,我们选用TNBS 100mg/kg作为体内研究造模剂量。2.四君子汤可降低TNBS诱导的UC大鼠DAI、CDMI、TDI评分值。HE染色结果表明SJZD具有修复损伤黏膜的作用,其中以中高剂量组(生药量5.6 g/kg)的治疗效果最明显。3.大鼠结肠紧密连接蛋白occludin与claudin-2主要分布在上皮细胞之间,TNBS诱导可降低大鼠结肠组织occludin、claudin-2 mRNA的表达,同时可使occludin与claudin-2蛋白表达量降低。SJZD中高剂量组(生药量2.8g/kg,5.6g/kg)可显著性恢复大鼠结肠紧密连接蛋白的表达。4.模型组大鼠结肠组织中的TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA表达较对照组显上升的趋势,四君子汤中高剂量(生药量2.8g/kg,5.6g/kg)组可降低结肠中TNF-α、 IFN-γ mRNA表达,低中高剂量(生药量1.4g/kg,2.8g/kg,5.6g/kg)对IL-6 mRNA表达均有下调作用。模型组大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β含量较对照组均升高,IL-1β的升高值具有显著性差别(P<0.05),小肠三叶因子TFF-3表达下降。四君子汤可降低大鼠血清中炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β的含量,升高小肠三叶因子TFF-3的含量。体外实验：1.不同浓度TNBS对Caco-2细胞均有一定的活力抑制作用,并呈一定的剂量和时间依赖性。我们选择TNBS 200μg/mL的浓度损伤细胞24h作为造模条件,结果表明可造成稳定的细胞损伤模型。2.四君子汤总多糖的多糖含量约为70%,一年内多糖含量稳定。蛋白质含量约为20%。3.四君子汤总多糖浓度在100-150μg/mL之间对受损的Caco-2细胞均有修复作用,其中以120μg/mL作用最显著。4.四君子汤总多糖给药24、36、48h内对受损Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1,2,4、ZO-1,2,3、occludin、E-cad mRNA表达有上调作用,其中以ZO-3、occludin、claudin-1较为明显。对紧密连接蛋白JAM mRNA影响不明显。同时,SJZD总多糖可上调受损细胞ZO-3、occludin、claudin-1蛋白表达。5.TNBS造模后Caco-2细胞细胞核中NF-κB含量升高,四君子汤总多糖给药9h可下调损伤后的Caco-2细胞细胞核中NF-κB的含量,结果与模型组比较具有统计学意义(P<0.05)。结论：四君子汤通过影响结肠上皮细胞黏膜的紧密连接蛋白表达,修复受损肠道黏膜屏障,对TNBS诱导的UC大鼠有治疗作用。其中的活性成分四君子汤总多糖可通过影响NF-κB相关通路,上调受损Caco-2细胞紧密连接基因和蛋白的表达。该课题的研究结果将为临床上使用四君子汤作为治疗UC疾病的基础方剂提供现代药理学理论依据,同时为进一步阐述四君子汤相关胃肠道药理作用机制研究奠定良好的前期基础。