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肝纤维化是许多慢性肝病的共同的病理过程,是肝脏的损伤修复性反应,主要表现为细胞外基质合成和降解失衡,导致肝脏内结缔组织异常沉积的病理过程。肝星状细胞(HSCs)活化被公认为肝纤维化发生发展的关键性环节。HSCs活化过程除受枯否细胞、炎细胞、受损肝细胞所释放的细胞因子或其它可溶性因子的影响外,目前已清楚基质金属蛋白酶-2(MMP-2)通过降解细胞外基质改变HSCs微环境,也可以促进HSCs的活化,活化后的HSCs又分泌大量的MMP-2,形成恶性循环。在肝纤维化形成过程中,Ⅳ型胶原的沉积提示MMP-2对其降解力度不够或酶的作用环境改变:而在肝纤维化的逆转期,MMP-2活性显著增强。显然,MMP-2与肝纤维化关系密切。所以搞清调节MMP-2表达及活性的因素不论对该病的预防还是治疗均有十分重要的意义。
肝脏感染或其他因素造成的损伤均可导致肝脏缺氧,而缺氧将加重肝损伤,促进纤维化发展。本组前期研究结果提示:氧能调节HSCs MMP-2表达及活性水平,缺氧情况下,大鼠HSCs表达MMP-2升高,但其酶活性下降;体内研究结果提示氧能通过调节肝星状细胞MMP-2表达及活性而影响肝纤维化的发展;另外还发现纤维化肝组织表达缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),而且几乎全是纤维间隔附近肝细胞表达。提示作为肝脏的主体细胞以及HSCs的近邻—肝细胞在氧对HSCs MMP-2表达及活性调节中可能起重要作用。
综上所述,氧和MMP-2与肝纤维化发生发展有重要关系,且氧对HSCs MMP-2表达及活性有重要调节作用,然而缺氧状况下,肝细胞对HSCs MMP-2表达及活性的调节机制尚不清楚。
第一部分缺氧肝细胞是否会影响大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性?
[目的]:缺氧的肝细胞对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)基质金属蛋白酶Ⅱ(matrix metalloproteinase2,MMP-2)表达及活性的影响。
[方法]:缺氧培养肝细胞BRL-3A(氧浓度5％)12小时后取其培养上清做为缺氧条件培养基培养肝星状细胞HSC-T6,6h,12h,24h后分别通过Realtime RT-PCR,Western blot,明胶酶谱法检测HSC-T6细胞MMP-2 mRNA、蛋白表达及酶活性。
[结果]:随缺氧条件培养时间的延长,三个时间点缺氧条件培养基组MMP-2 mRNA(8.0278±1.09,20.44±1.44,25.16±1.76)明显高于正常条件培养组(4.29±1.34,10.08±1.53,21.61±1.18)和DMEM组(1±1.20,3.47±1.11,20.04±1.80),差异具有统计学意义(P＜0.001)。MMP-2蛋白表达缺氧条件培养基组(0.99±0.02,1.12±0.06,1.38±0.08)也显著高于正常条件培养基组(0.86±0.04,0.92±0.04,1.17±0.04)和DMEM组(0.50±0.05,0.67±0.03,1.05±0.02),差异具有统计学意义(P＜0.001),而MMP-2酶活性缺氧条件培养基组(3377.87±380.05,12090.19±823.17,11146.79±247.46)则显著低于正常条件培养基组(6795.63±348.31,19663.99±934.82,25741.95±1586.77)和DMEM组(4840.13±628.20,5455.12±383.88,3983.47±143.09),差异具有统计学意义(P＜0.001)。
[结论]:物理缺氧条件下,肝细胞分泌或释放了可溶性物质,作用于肝星状细胞使其MMP-2在mRNA和蛋白水平上表达上调,活性下降。究竟是何种物质尚待进一步研究。
第二部分缺氧肝细胞释放的ROS影响大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性
[目的]:研究缺氧肝细胞释放的ROS对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性的影响。
[方法]:①通过原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrophotometry)检测缺氧条件培养基及缺氧条件培养后的肝星状细胞上清中锌(Zn)离子浓度。②对肝细胞进行缺氧处理12h(氧浓度21%,10%,5%),通过活性氧比色法检测缺氧条件培养基中活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度。③将还原型谷胱甘肽(glutathion,GSH)(0,0.5,2.5,10 mmol/L)加入缺氧肝细胞中,采用活性氧比色法检测缺氧后肝细胞上清中ROS含量。④以还原型谷胱甘肽(glutathion,GSH)(0,0.5,2.5,10 mmol/L)中和缺氧缺氧条件培养基中的ROS,以此条件培养基培养肝星状细胞HSC-T6,6h,12h,24h后,通过Realtime RT-PCR,Western blot,明胶酶图法分别检测HSC-T6细胞MMP-2mRNA、蛋白表达及其酶活性。
[结果]:①随着培养时间的延长,缺氧条件培养基中Zn浓度逐渐下降。②随着氧浓度(21%,10%,5%)的降低,肝细胞培养上清中的ROS逐渐升高(0.1941±0.007,0.2317±0.020,0.2588±0.009),差异具有统计学意义(P＜0.05)。③随着GSH浓度增加(0,0.5,2.5,10 mmol/L),ROS浓度逐渐下降(0.2589±0.003,0.2469±0.002,0.2288±0.003,0.1598±0.004),差异具有统计学意义(P＜0.05)。④随着GSH浓度增加,MMP-2mRNA、蛋白表达及MMP-2酶活性均逐渐下降。差异均具有统计学意义(P＜0.001)。
[结论]:①Zn浓度的下降与MMP-2活性变化不一致。②随着氧浓度的降低,缺氧肝细胞产生的ROS逐渐增加。③GSH能够有效的清除缺氧条件培养基中的ROS。④ROS是缺氧肝细胞释放的可以使肝星状细胞MMP-2 mRNA、蛋白表达和括性均升高的因子。
第三部分缺氧肝细胞释放的ROS影响肝星状细胞HSC-T6MMP-2表达的信号通路
[目的]:研究缺氧肝细胞释放的ROS影响肝星状细胞HSC-T6 MMP-2表达的信号通路。
[方法]:①Western blot检测缺氧条件培养后的肝星状细胞HSC-T6细胞内磷酸化IκB-α的表达变化。②将NF-κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082加入缺氧条件培养的肝星状细胞HSC-T6中,Western blot检测磷酸化IκB-α的表达水平。③以BAY11-7082阻断缺氧条件培养的肝星状细胞中NF-κB信号通路,Western blot检测其MMP-2表达水平。
[结果]:①缺氧条件培养基组肝星状细胞HSC-T6中磷酸化IκB-α的表达显著升高(P＜0.05)。②加入BAY11-7082后,Western blot结果显示磷酸化IκB-α的表达水平明显下降(P＜0.001)。③Western blot显示加入BAY11-7082后,缺氧条件培养基组肝星状细胞HSC-T6 MMP-2的表达水平(0.2329±0.018)明显低于未加BAY11-7082组(1.2417±0.019)及DMEM组(0.6128±0.039),差异具有统计学意义(P＜0.001)。
[结论]:缺氧肝细胞释放的ROS通过NF-κB信号通路影响肝星状细胞HSC-T6 MMP-2衷达。