人口老龄化已经成为很多国家不得不面对的挑战,衰老相关疾病如肿瘤等依然困扰着人类。衰老是生命个体的自然进程。如何能在减缓衰老进程的同时,减少老年疾病的发生,一直是人们研究的热点。一些早衰性疾病的发生为研究衰老提供了很好的模型,构建早衰动物模型已经成为人们研究衰老机制的重要手段。Werner综合征（Werner Syndrome,WS）是一种人类常染色体隐性遗传病,是由于RECQ解旋酶家族中的WRN基因突变引起,WS的临床表现为过早衰老和肿瘤易感等。由于小鼠的端粒长度较长并且小鼠体细胞内具有端粒酶活性,为了构建WS小鼠模型,需要同时敲除Wrn基因和端粒酶基因,当Wrn基因和端粒酶基因敲除的小鼠繁殖到第五代时（G5DM）,小鼠表现出与人类WS相仿的早衰表型。前期研究人员在对G5DM的小鼠成纤维细胞（Mouse embryo fibroblasts,MEFs）培养过程中发现部分细胞可以逃逸衰老,发生永生化。并且其中一些永生化细胞可在SCID小鼠中成瘤,在这些可在SCID小鼠成瘤的细胞中都发现了抑癌基因p53的同一个位点突变(p53N236S)。由于这些肿瘤没有端粒酶活性,所以是通过端粒延长替代机制（Alternative lengthening of telomere,ALT）来维持端粒的。p53被称为基因组的守护者。通过对应激信号（DNA损伤等）响应,p53被激活,触发瞬时的细胞周期停滞、细胞死亡（细胞凋亡）或永久性细胞周期停滞（细胞衰老）。细胞凋亡和细胞衰老都是有效的肿瘤抑制机制,它们可有效地阻止受损细胞发生肿瘤转化。但是,这两个过程也会耗尽具有增殖能力的祖细胞或干细胞,损害组织的结构和功能。尽管凋亡细胞可以从组织中被清除,但是衰老细胞可以持续存在,从而通过衰老表型的方式改变组织的微环境,促进癌症和衰老相关疾病的发生。p53作为抑癌基因,在超过50%的人类肿瘤中发生突变。本研究关注的p53N236S突变是发生在p53 DNA结合区域的点突变,p53蛋白第236位氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸。我们的前期研究发现p53N236S不仅失去了野生型p53功能,还获得了一些癌基因的新功能。为了进一步研究p53N236S突变,实验室前期构建了p53N236S转基因小鼠,小鼠表现出肿瘤高发并且转移性较强的表型。由于p53N236S突变是从WS逃逸衰老的细胞中筛选出来的,为了研究p53N236S突变对WS衰老的作用,进而研究衰老与肿瘤的互作关系,我们把p53N236S突变通过杂交的方式引入具有Wrn和端粒酶RNA模板（Terc）双敲除的WS（Double mutant,DM）小鼠中,形成了Wrn、Terc、p53N236S三基因突变的小鼠（Triple mutant,TM）。为了研究p53N236S对Wrn综合征早衰小鼠存活的影响,前期研究人员绘制了（G1,G2,G3）TM小鼠和（G1,G2,G3）DM小鼠的生存曲线,发现G5TM的小鼠平均寿命（165±19天）比G5DM小鼠平均寿命（120±6天）长。后进一步发现p53N236S对Wrn综合征诱导的衰老依赖于端粒的长度,通过TRF-Southern技术对细胞的端粒信号进行检测,实验结果表明,在G1DM,G3DM,G5DM细胞中,端粒的信号逐渐减弱:而在G1TM,G3TM,G5TM中端粒信号并没有明显的减弱。在DM小鼠中,随着代数的增加端粒逐渐缩短,寿命随着小鼠代数不断降低,提示着端粒长度与寿命的相关性,与文献报道一致。但在TM的细胞中,端粒信号并未显示出明显的随代数缩短,提示我们p53N236S可能可以保护端粒,降低端粒减短的速度,同时p53N236S可能参加了端粒的延长替代机制,维持端粒长度,延长小鼠的寿命。前期的研究发现三基因突变的小鼠繁殖到第五代（G5TM）比G5DM小鼠寿命更长,并且目前为止,我们没有发现形成自发肿瘤的G5TM小鼠。这些数据提示我们,G5TM小鼠可能延缓了WS小鼠的衰老表型,且抑制了p53N236S小鼠的肿瘤表型,但是其中的分子机制不清楚。为了研究p53N236S延长WS小鼠寿命的分子机制,我们制作了G1,G3,G5DM/TM、WT、p53-/-、p53S/S的MEF细胞。结果表明,在细胞培养过程中,G5DM细胞最多传代到第六代就发生严重衰老而无法传代,而G5TM细胞一直保持较好的增殖状态,类似于永生化细胞,可正常传代六十代而依旧保持较快增殖。我们通过SA-β-gal染色来观察G5DM和G5TM的细胞衰老状况,G5DM细胞从第三代开始就出现染色阳性的衰老细胞,而G5TM第六十代的细胞还没有出现衰老染色阳性细胞。通过原位荧光探针杂交实验结果发现G5TM细胞端粒比G5DM细胞端粒更长。进一步对细胞进行核型分析以及端粒荧光探针杂交的结果表明,G5TM第六十代细胞的端粒异质性较强,同一个细胞内有些端粒较长,有些端粒较短甚至完全丢失。有端粒之间发生了交换也有染色体由于端粒较短发生了融合,提示G5TM细胞通过ALT机制延长端粒,同时细胞可以正常传代,并没有走向衰老。Wrn作为DNA解旋酶在DNA复制中发挥重要的功能,DNA复制是细胞周期的重要环节,于是我们用流式检测了G5DM和G5TM细胞周期,结果发现较多带有p53N236S的细胞中具有染色体多倍体的存在。进一步实验发现带有p53N236S的细胞在经过一定次数传代后所有细胞都变为多倍体细胞。这些数据表明p53N236S突变可以诱导细胞自发形成多倍体。已有研究表明植物可以通过形成多倍体增加抗逆性,我们猜测p53N236S突变是不是也可通过形成多倍体的方式应对DNA损伤及复制压力呢?为了验证这一假说,我们检测了p53S/S细胞和WT细胞对纺锤体毒性药物诺考达唑和紫杉醇的耐受性,药物的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）值和凋亡实验结果显示p53S/S细胞对诺考达唑和紫杉醇具有更强的抗性。提示p53N236S使细胞可以通过形成多倍体的方式面对复制压力。由于多倍体的形成常会诱导肿瘤的发生,我们对p53S/S多倍体细胞和TM多倍体细胞的成瘤性进行验证,这些结果显示p53S/S多倍体细胞可以在SCID小鼠中形成肿瘤,而TM多倍体细胞并未成瘤,说明p53N236S突变的成瘤性不强。那么,G5TM小鼠体内是否存在多倍体细胞呢?为了进一步研究在小鼠体内的状况,我们对TM和DM小鼠的骨髓细胞进行细胞周期检测和核型分析,结果发现TM小鼠骨髓中有约5.8%的细胞DNA量为8N的（二倍体小鼠细胞在G0/G1期DNA量为2N）,并且TM小鼠骨髓核型中存在细胞染色体条数为80条,说明TM小鼠骨髓中具有四倍体细胞。这些结果提示,G5TM小鼠可能通过促进多倍体形成应对Wrn和端粒酶缺失所导致的DNA损伤,延长早衰小鼠的寿命。为研究p53N236S对细胞周期及端粒维持的调控机制,我们检测了G5TM及G5DM细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI）、DNA修复相关以及端粒维持相关基因的表达。转录组测序（RNA Sequencing,RNA-seq）数据显示,除了p21/Cdkn1a外的几种CKI（p16/Cdkn2a、p15/Cdkn2b、p18/Cdkn2c、p19/Cdkn2d、p27/Cdkn1b、p57/Cdkn1c）在G5TM细胞中均高表达。我们通过蛋白免疫印迹实验验证了其中的p16、p19、p21、p27的蛋白表达,除了p21蛋白在G5TM细胞中低表达外,p16、p19、p27蛋白都在G5TM细胞中高表达,结果与RNA-seq数据一致,而G5TM细胞并未显示出明显的周期阻滞,可能是由于p21在细胞周期阻滞中的作用更加重要,或是这几种CKI蛋白突变或修饰失去其周期抑制功能。实时荧光定量PCR数据显示:相比G5DM,在G5TM细胞中范可尼贫血相关基因Fanca,Fancb,Fancc,Fancd1（Brca2）,Fancd2,Fanci,Fancj（Bach1）,Fancm,Fanco（Rad51c）,Fancr（Rad51）,与端粒维持以及DNA修复相关的Recql4,Timeless,Blm高表达。其中Brca2,Rad51与同源重组修复相关,它们的高表达可能提升了DNA尤其是端粒DNA的修复并且可能启动了ALT途径来延长端粒长度。Recql4,Blm与Wrn蛋白同属RECQ解旋酶,它们的表达升高可能代偿了一部分Wrn蛋白的功能,减缓了端粒缩短的速度,延长了小鼠的寿命。文献显示上述范可尼和端粒维持以及DNA修复相关基因的表达的受DREAM复合物调控,我们的前期实验结果显示p53N236S失去了对p21/Cdkn1a的调控能力,TM细胞中p21/Cdkn1a低表达,而p21/Cdkn1a促进DREAM复合物转变为转录抑制因子。结合RNA-seq,我们发现在G5TM细胞中B-myb（Mybl2）,Foxm1高表达,促进DREAM复合物由转录抑制因子转变为了转录促进因子,可能因此导致众多DNA修复和端粒维持相关基因高表达,提升细胞的修复能力。我们通过蛋白免疫印迹实验验证了Foxm1蛋白,以及受DREAM通路调控的Gins2,Pol E,Timeless,Bubr1,Bub1,Rad51,PCNA,Mcm7,Mcm2等蛋白表达,数据显示,相比于G5DM细胞,这些蛋白在G5TM细胞中高表达并且在形成多倍体后表达量进一步增高。综上所述,p53N236S突变可使细胞面对复制压力时形成多倍体,提高细胞对DNA损伤的耐受性。同时p53N236S通过调控DREAM复合物促进DNA修复及端粒维持蛋白的表达,提高了细胞的DNA损伤修复能力,并启动了端粒延长的替代机制,因此缓解了WS导致的衰老表型。p53在机体中维持着巧妙的平衡,这种平衡与肿瘤和衰老密切相关,改变正常p53的表达会让肿瘤与衰老之间失衡。我们的研究发现p53N236S在G5的WS小鼠中显示出了延长寿命并且不形成肿瘤的效果,为同时预防衰老和肿瘤提供了一个新思路。