研究背景和目的：乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国居女性恶性肿瘤的第一位,严重威胁着人们的生命健康。近些年来,由于对乳腺癌的早期发现,以及综合治疗手段的不断提高,其死亡率呈逐年下降趋势。然而伴有远处转移或复发患者的预后仍然很差。肿瘤转移由于治疗效果差,已经成为致患者死亡的主要原因。我们的研究试图通过对乳腺癌细胞的趋化运动机制的探索来了解ELMO是如何调控乳腺癌细胞的迁移。趋化因子CXCL12及其G-蛋白偶联受体CXCR4能够介导乳腺癌细胞的迁移,侵袭和转移。但是,目前趋化因子和G蛋白偶联受体信号通路对于肌动蛋白聚合和肿瘤细胞趋化运动的通路尚不明确。尤其是趋化因子-G蛋白偶联受体-Rac的激活-肌动蛋白聚合／ELMO蛋白,在肿瘤趋化运动和转移中是以何种机制来发挥作用的将是我们的研究重点。从而更进一步深入了解乳腺癌细胞的趋化运动和转移机制,为乳腺癌的诊断和治疗提供可靠的分子基础。研究方法：1)应用Western Blot的方法检测不同乳腺细胞中的ELMOs蛋白表达水平。2)应用Wound healing Assay、Chemotaxis Assay、Invasion Assay、F-actin Polymerization Assay检测ELMO1蛋白降表达后,对于乳腺癌细胞迁移和趋化运动的影响。3)应用MTT方法检测ELMO1是否对于乳腺癌细胞增殖有影响。4)应用质谱学分析方法,以求找到与ELMO1相互作用的重要蛋白,并应用Co-IP的实验技术进一步验证。5)利用免疫荧光共聚焦的实验技术和细胞成分分离的方法检测ELMO1在细胞中的定位以及与Gai2共定位的现象。6)建立ELMO1降表达稳定细胞系,肿瘤原位接种到小鼠脂肪垫上,构建肺转移模型,探讨ELMO1降表达在小鼠体内转移的影响。7)免疫组化方法检测ELMO1在人乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达,分析ELMO1的表达水平与肿瘤转移等临床病理参数的相关性。结果：1) ELMO1可以促进乳腺癌细胞迁移、趋化运动和侵袭的能力。我们首先观察了ELMOs蛋白在MDA-MB-231,BT549,ZR-75-30,MCF-7, T47D,BCAP-37,SKBR3,MCF10A和HBL100的9种人乳腺细胞表达水平,ELMO1和ELMO2均有不同程度的表达。并且在较高转移性的乳腺癌细胞诸如MDA-MB-231和BT549中高表达。为了研究ELMOs蛋白对人乳腺癌细胞的迁移能力影响,我们在人乳腺癌细胞MDA-MB-231和其他两个乳腺癌细胞株T47D和MCF-7采用基因沉默技术抑制ELMO1的表达,然后运用体外transwell实验技术检测。我们发现,趋化因子CXCL12对MDA-MB-231,T47D和MCF-7细胞有明显诱导的趋化作用,而基因沉默ELMO1则抑制CXCL12诱导的趋化作用。另外检测表明基因沉默ELMO1的细胞株表现为迁移能力降低。为了检测CXCL12介导的MDA-MB-231细胞的侵袭能力,我们使用了体外基质胶侵袭实验技术。MDA-MB-231细胞(正常和对照组)表现出明显的侵袭能力,而siELMO1细胞株则侵袭功能受到抑制。百日咳毒素(PTX)是Gai信号通路的特异性抑制剂,使用百日咳毒素(PTX)处理细胞后发现CXCL12所介导的肿瘤细胞的趋化作用和迁移能力进一步受到抑制。在siELMO1沉默表达的细胞中肌动蛋白的聚合水平则是下调的,这种下调作用在PTX作用下更为明显。我们还利用了MTT的检测方法研究ELMO1对乳腺癌细胞的增殖作用,结果表明siELMO1细胞没有表现出对细胞增殖明显的抑制作用。2)通过质谱分析鉴定出与ELMO1相互作用的蛋白质。同时,ELMO1的N末端与Gai2亚基相互结合。CXCL12的刺激可以促进Gai2与ELMO1蛋白N末端的结合,并且Gai2-ELMO1/DOCK180途径在趋化因子受体所介导的乳腺癌细胞迁移、趋化运动和转移中发挥重要作用。3) CXCL12诱导ELMO1跨膜移位。趋化因子刺激前,Gai2比ELMO1更加明显定位在细胞膜上,在CXCL12刺激的情况下,ELMO1显著地转运到细胞膜上并与Gai2共定位(相互结合)。相反,在Gai2基因沉默的细胞中无论是否受到CXCL12的刺激,ELMO1转运到细胞膜的能力被抑制。上述结果表明,CXCR4趋化受体的激活可以诱导依赖于Gai2的ELMO1蛋白跨膜运动。4) CXCL12诱导Rac的激活和跨膜。CXCL12所诱导的Racl和Rac2的激活作用可以通过阻断Gai通路(PTX处理细胞)或者ELMO1基因沉默而被抑制。趋化因子CXCL12可以激活Gai通路并引发ELMO1/DOCK180复合体激活Racl和Rac2。5) ELMO1对于PDK1/AKT和ERKl/2的激活是非必须的。利用生化检测方法我们发现CXCL12诱导的PDKl和AKT的膜转运在siELMO1细胞和对照组乳腺癌细胞中都有发生。另外,在siELMO1和对照组细胞中,PDK1和AKT的磷酸化水平并无明显变化,而且在CXCL12诱导下,ERKl/2的激活也未观察到明显的改变。因此,无论是PDK1/AKT还是ERKl/2的激活通路,均不依赖于ELMO1。6) ELMO2在乳腺癌趋化运动中也发挥着相似的功能,调控乳腺癌细胞的趋化运动。ELMO2-YFP也可以免疫共沉淀DOCK180,Gai2,Racl和Rac2。 CXCL12的诱导可以激活Racl和Rac2,但在PTX处理抑制了Gai通路或者siELMO2细胞中则不能激活Racl和Rac2,同时CXCL12诱导的肌动蛋白聚合能力和趋化运动在siELMO2细胞中受到抑制。研究结果表明,ELMO1和ELMO2在CXCL12诱导的乳腺癌细胞MDA-MB-231趋化运动中发挥着相似的功能。7)在活体内,ELMO1对于乳腺癌的转移同样起着重要的作用。我们首先检测了ELMO1和ELMO2乳腺组织中的表达情况。ELMO1/ELMO2在乳腺癌的组织中高表达。此外,ELMO1的表达水平还与乳腺癌的转移息息相关。我们还在SCID小鼠体内检测了ELMO1与乳腺癌转移的关系,建立了乳腺癌肺转移模型。研究结果表明ELMO1尽管在肿瘤生长过程中是非必要的,但是其在肿瘤体内转移的过程中起着重要的作用。结论：1)ELMO1可以促进乳腺癌细胞迁移、趋化运动和侵袭的能力。2)通过质谱分析鉴定出与ELMO1相互作用的蛋白质。3)CXCL12诱导ELMO1跨膜移位。4)CXCL12诱导Rac的激活和跨膜。5)ELMO1对于PDK1/AKT和ERK1/2的激活是非必须的。6)ELMO2在乳腺癌趋化运动中也发挥着相似的功能,调控乳腺癌细胞的趋化运动。7)在活体内,ELMO1对于乳腺癌的转移同样起着重要的作用。