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RNA沉默是生物抵御外来核酸入侵以保持生物自身基因组完整性的一种高度保守的、序列特异的RNA降解机制,广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生物中。RNA介导的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance, RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的转录后基因沉默,具有抗病程度高、抗性持久及生物安全性高等优点。在前期的研究中,人们发现并非所有符合条件的siRNA都同样有效,具体原因还不清楚,可能是“位置效应”(position effects)所致。本研究首先以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)外壳蛋白基因(CP)不同区段50bp的序列为靶序列构建发夹RNA (hpRNA)结构的植物表达载体,系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响。在此基础上,以水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) CP基因5’端、中间和3’端500bp的序列为靶序列,构建hpRNAi植物表达载体,转化水稻,进一步比较了不同位置的靶序列对RNA介导的病毒抗性的影响,筛选获得了高抗RBSDV的转基因水稻新材料。研究结果对有效地选择靶位点序列和高效地应用RMVR策略培育抗病毒转基因植物具有重大指导意义。研究结果和主要结论如下：1.马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVYN CP (801bp)划分为长度为50bp的16个短片段,进而利用PCR技术扩增CP基因5’端8个目的片段,反向重复插入植物表达载体pROKⅡ中,构建了具有hpRNA结构的植物表达载体pROK-CPs (pROK-CP1～pROK-CP8)。将构建好的16个重组植物表达载体(3’端的8个载体由姜芳构建)利用冻融法导入农杆菌EHA105,并瞬时侵染本生烟以验证其有效性。Northern blot结果显示,16个植物表达载体不仅均能在植物体内成功表达产生siRNA,而且瞬时表达的siRNA能对靶基因PVYCP的农达进行有效地下调。采用冻融法将构建成功的植物表达载体导入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得T0代转基因植株。T0代自交所获得的种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选,选取抗性幼苗进行温室移栽并进行PCR检测,结果农明,转化pROK-CP1～pROK-CP8分别获得60、55、70、66、66、48、68和72株T1代转基因植株。以PVYN的病毒汁液为接种物,摩擦接种16个载体的转基因烟草(3’端的8个载体的转基因烟草山姜芳转化获得),通过症状观察及ELISA检测进行抗病性分析发现,转化pROK-CP1～pROK-CP4所得的转基因植株抗性植株比例均为0%,而转化pROK-CP5～pROK-CP16的转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15%、6.27%、67.65%、70.83%、66.01%、61.34%、66.04%、23.59%、11.11%、55.56%、77.78%和67.25%。结果表明,以CP基因3’端为靶序列比以5’端为靶序列更能有效地介导对PVY的抗性。T1代转基因植株的Northern blot杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,即抗性与RNA积累量呈负相关,同时,在所有转基因植株中均能检测到siRNA,表明植株对病毒的抗性是由RNA所介导的,但植株的抗病性与siRNA积累量之间没有明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果表明,由hpRNA介导的PVY抗性可以在T2代植株中稳定遗传。2.水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对hpRNA介导的病毒抗性影响利用PCR技术扩增来自RBSDV CP5端、中间和3’端长度为500bp (nt89-588, nt589-1088, nt1089-1588)片段,构建hpRNAi植物表达载体RBSDV-CP5’、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3’,酶切鉴定表明植物表达载体构建成功。将构建好的三个重组表达载体利用冻融法导入农杆菌EHA105中,采用农杆菌介导法转化镇稻88。转化RBSDV-CP5’、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3’的转基因植株,经除草剂和PCR检测,分别获得19、21和22株T0代转基因阳性植株。将T0代自交结实后获得的T1代转基因植株,利用叶片涂抹PPT的方法,筛选T1代阳性转基因植株。每个株系各选取50株阳性植株,用来自山东济宁的带毒灰飞虱接种病毒RBSDV,病毒抗性的检测结果显示：转RBSDV-CP5’、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3’的T1代转基因株系中抗病株系的比率分别为15.80%、23.81%、27.27%,表明靶向于RBSDV CP3端的hpRNA可介导更高的抗病性。T1代转基因植株的Northern杂交分析显示,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,并且转基因植株中有siRNA存在,这表明病毒抗性是由RNA介导的。但同时还发现siRNA积累量与植物抗性之间没有明显的相关性。