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背景与目的骨关节炎(osteoarthriti,OA)是一种常见的以关节软骨丢失和骨赘形成为主要病理表现的关节疾病。关节软骨的退变是OA发病机制的关键环节。软骨退变的主要病理表现为软骨细胞的衰老和凋亡。因此,维持关节软骨细胞的活力对预防OA非常关键。目前研究表明OA的发生与软骨组织中自噬水平的降低有关。自噬水平的部分恢复可能有助于提高OA的软骨细胞活力。瞬时受体电位通道(transientreceptorpotentialchannel,TRPC)通过对Ca~(2 )的调控来调节细胞的多种生理活动,包括自噬和凋亡等。目前TRPC介导自噬的机制研究仍处于早期阶段,且有关TRPC在OA和关节软骨中的研究很少报道。研究表明贯叶金丝桃素四氢衍生物tetrahydrohyperforin(IDN5706)可诱导自噬来发挥抗神经退化作用。此外,IDN5706可改善阿尔茨海默症大鼠的空间记忆,其机制与激活TRPC3/6/7有关。目前有关IDN5706在OA中的作用尚未见报道。因此,本研究拟探讨IDN5706对OA软骨退化的作用,并分析IDN5706是否通过调控TRPC钙离子通道蛋白激活自噬,从而发挥改善OA病理损伤的作用。方法1.体内探究IDN5706对OA大鼠软骨组织中自噬水平和软骨退化的影响将Sprague-Dawley(SD)大鼠称重并随机分为三组:正常对照组、OA模型组、IDN5706组。模型组大鼠于右后膝关节内注射II型胶原酶溶液构建大鼠膝OA模型,分别在第1天和第4天各注射一次。OA建模两周后,IDN5706组大鼠每周一次灌胃给予6g/kg(大鼠重量)IDN5706,持续6周。之后处死大鼠并分离膝关节软骨组织,行苏木精-伊红(Haematoxilin-Eosin,HE)染色和番红-O(safraninO)染色,应用Mankin评分系统对关节软骨退变行组织学评估。荧光定量PCR检测正常大鼠和OA大鼠中膝关节软骨组织中基质金属蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13,MMP-13)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表达水平。透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体。Westernblot检测mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1和LC3-I、LC3-II的蛋白表达。2.体外探究IDN5706是否可通过激活自噬抑制软骨细胞的凋亡和OA相关因子的表达从OA大鼠的膝关节分离软骨细胞,采用IDN5706(50,100,150和200μmol/L)处理24h后,CCK-8试剂盒检测细胞软骨细胞活力。采用50μmol/L的IDN5706处理OA软骨细胞24h后,ELISA法检测细胞培养基上清中MMP-13和IL-6的水平,Westernblot法检测软骨细胞mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1和LC3-I、LC3-II的蛋白表达;或采用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)预处理OA软骨细胞1h,再用IDN5706处理24h后,AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞术检测对软骨细胞凋亡的影响,ELISA法检测细胞培养基上清液中MMP-13和白介素-6(interlukin-6,IL-6)的水平。3.体内外探究IDN5706是否可通过上调TRPC6介导的自噬来抑制OA软骨细胞的凋亡和OA相关因子的表达,并改善OA大鼠病理损伤采用荧光定量PCR和Westernblot分别检测正常大鼠和OA大鼠软骨组织以及IDN5706治疗后的软骨组织中TRPC6的mRNA和蛋白表达水平。然后体外实验:分离正常软骨细胞和OA软骨细胞,OA软骨细胞转染TRPC6siRNA,并用IDN5706处理,AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞术检测软骨细胞凋亡情况,ELISA法检测细胞培养基上清中MMP-13和IL-6的水平,Westernblot检测mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1和LC3-I、LC3-II的蛋白表达。体内实验:将SD大鼠随机分为5组:正常对照组、OA模型组、IDN5706组、IDN5706 TRPC6抑制剂SAR7334组、IDN5706 自噬抑制剂3-MA组。IDN5706 SAR7334组和IDN5706 3-MA组大鼠在IDN5706灌胃的同时注射SAR7334或3-MA。在IDN5706灌胃6周后处死大鼠并分离膝关节软骨组织,行HE和safraninO染色,应用Mankin评分系统对关节软骨退变行组织学评估。Westernblot检测软骨组织中mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1和LC3-I、LC3-II的蛋白表达。结果1.IDN5706对OA大鼠关节软骨退化和软骨中自噬的影响HE染色和safraninO染色显示,IDN5706可减轻OA的病理损伤,减缓OA软骨退变。此外,IDN5706处理显著降低OA大鼠关节软骨组织中高表达的MMP-13和VEGF的mRNA水平。透射电镜观察到正常大鼠关节软骨细胞结构完整,而相比于正常组,OA大鼠关节软骨组织中胞质细胞器数量减少,线粒体肿胀、空泡变性,并且双膜自噬体也减少。与OA组相比,IDN5706处理后,双膜自噬体增加。另外,Westernblot结果发现,与正常组相比,OA大鼠关节软骨组织中自噬标志蛋白(包括LC3、Beclin-1和Atg5)的蛋白水平降低,mTOR的磷酸化水平升高。IDN5706处理OA大鼠后导致关节软骨组织中LC3-II/LC3-I的比值、Beclin-1和Atg5的蛋白水平显著升高,mTOR磷酸化水平显著降低,提示IDN5706上调OA中被抑制的自噬水平。2.IDN5706对软骨细胞的凋亡和OA相关因子的表达的影响及自噬相关机制的探究不同浓度IDN5706处理后的OA软骨细胞的活力没有统计学差异,表明IDN5706对软骨细胞没有明显毒性,我们采用50μmol/L的IDN5706做后续实验。ELISA结果表明IDN5706处理显著降低OA软骨细胞上清液中MMP-13和IL-6的水平,降低OA软骨细胞中mTOR磷酸化水平,升高LC3-II/LC3-I的比值、Beclin-1和Atg5的蛋白水平,且抑制OA软骨细胞的凋亡率。3-MA抑制自噬则减弱了IDN5706对OA软骨细胞凋亡和OA相关因子的抑制作用。3.TRPC6和自噬在IDN5706抑制软骨细胞的凋亡和OA相关因子的表达和改善OA大鼠病理损伤中的作用OA大鼠软骨组织中的TRPC6的mRNA和蛋白水平显著低于正常大鼠,IDN5706处理显著升高OA大鼠软骨组织中的TRPC6的mRNA和蛋白水平。体外实验表明,敲除TRPC6减弱了IDN5706对OA软骨细胞凋亡和OA相关因子(MMP-13和IL-6)的抑制作用。敲除TRPC6还显著升高了OA软骨细胞中mTOR磷酸化水平,降低LC3-II/LC3-I、Atg5、Beclin-1,提示敲除TRPC6抑制OA软骨细胞的自噬。更重要的是,敲除TRPC6显著减弱了IDN5706对OA软骨细胞中自噬水平的上调作用。体内实验表明,相比于IDN5706组,TRPC6抑制剂SAR7334和自噬抑制剂3-MA处理后OA大鼠关节软骨细胞数量减少,Mankin评分升高。这些结果表明抑制TRPC6和自噬可减弱IDN5706对OA病理损伤的改善作用。此外,相比于IDN5706组,SAR7334处理显著降低OA大鼠关节软骨组织中LC3-II/LC3-I的比值、Beclin-1和Atg5的蛋白水平,升高mTOR磷酸化水平,表明SAR7334减弱IDN5706对软骨组织自噬水平的上调作用,提示TRPC6介导IDN5706对自噬的上调作用。结论1.IDN5706促进自噬且减慢OA大鼠关节软骨退化;2.IDN5706通过激活自噬抑制OA来源的软骨细胞的凋亡和OA相关因子的表达;3.IDN5706通过上调TRPC6介导的自噬抑制OA来源的软骨细胞的凋亡和OA相关因子的表达,改善OA大鼠病理损伤。