神经生长抑制因子和小分子G蛋白Rab3a的表达和纯化及其在脑组织中的定位研究

来源 :锦州医学院 辽宁医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wuyongliang0907
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神经生长抑制因子(GIF)特异地分布于脑组织中,是金属硫蛋白家族中唯一具有明确生理功能的成员,在Alzheimers症脑提取物存在下,对神经细胞的生长还具有抑制作用。Rab3a为小分子G蛋白的一种,属于v-SNARE蛋白,通常以一种Ca2+依赖形式在调控神经递质释放的过程中起着十分重要的作用。 目的:用酵母双杂交的方法已证实在GIF和Rab3a间存在相互作用,本文进一步用免疫组织化学的方法验证二者间的相互作用。 方法:采用GST表达系统在E.coli中把构建好的质粒pGEX-4T-GIF、pGEX-4T-Rab3a,经转化、诱导表达、亲和层析、凝血酶切和进一步纯化,测其电泳行为,得到GIF和Rab3a目的蛋白。利用已纯化好的目的蛋白做标准品,用直接型酶联免疫吸附测试(ELISA)方法初步测定AD病人脑提取物中GIF和Rab3a的蛋白含量。利用酶标定和荧光标定的免疫组化方法,确定GIF和Rab3a蛋白在大鼠脑中的定位及其二者的共定位。 结果:成功表达纯化得到了GIF和G蛋白Rab3a蛋白,利用GIF和Rab3a多克隆抗体用ELISA方法对AD症病人脑提取物中两蛋白的含量进行初步测定,结果表明在AD症病人的脑提取物中存在这两种物质。用ABCKit进行酶标定测得GIF和Rab3a在大鼠大脑中的主要分布区域为脑皮层、海马等部位,用荧光双标定的方法确定GIF和Rab3a两蛋白能在脑组织中共定位。 结论:GIF和Rab3a广泛分布于脑组织中,且二者有共定位行为,为二者间存在相互作用提供了有力的证据。
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