研究背景骨折、骨肿瘤、老年性骨质疏松和人工关节的翻修等是骨科的常见病和多发病，这些疾病在治疗过程中，常常因骨质缺损，而要进行骨移植修复。随着现代人口老化，骨移植的病例将越来越常见。骨移植是仅次于输血的第二大移植组织。自体骨移植目前依然被认为是植骨的“金标准”，因为它具备了理想骨移植的三大要素即1)骨引导基质；2)骨干细胞；3)骨诱导生长因子。但自体骨移植也有其不足，首先是增加了病人手术痛苦和手术时间，术后感染、疼痛、局部出血和神经损伤等问题，其次是骨块来源有限。对于这些情况，目前临床上主要应用同种异体骨和异种异体骨。这两种移植骨除了存在免疫排斥问题外，同时存在传染疾病的潜在风险。针对自体骨和异体骨存在的种种问题，人们对人工骨的研究热情与日俱增。人工骨不仅来源广，存储方便，无需骨库，可根据需要改变结构和力学性能，并可根据骨缺损形态进行塑形。它能原位固化，这为开展微创外科治疗提供了良好的途径。目前在临床上应用较多的是硫酸钙和磷酸钙类人工骨。硫酸钙用于填充骨缺损由来已久，硫酸钙具有良好的生物相容性，但缺点是吸收较快和支撑强度低，与骨生长不同步，不利于大块骨缺损的修复。磷酸钙作为一种骨的修复材料，在临床上以应用了100多年。1986年，Brown和Chow第一个研制出了一种新型可原位固化的磷酸钙人工骨，这个发现将磷酸钙作为替代骨推向了一个新时代。通过不同钙磷化合物的配比，可以制备出不同部位需要的可进行调控降解的人工骨产品。由于可注射性人工骨的终产物具有较大的表面积，因此比传统的磷酸钙产品具有更好的可降解性。但是，目前临床上所应用的可注射性磷酸钙人工骨仍有一定的缺陷，主要问题表现在人工骨的凝固时间、机械强度、临床操作、体内抗崩解性、降解后剩余产物的成分等方面尚不能达到理想的人工骨所要求的各种应用条件。磷酸钙在体内的降解吸收速度较慢，不利于新骨长入；而硫酸钙的降解吸收则比新骨的生长速度还要快，也不利于新骨的形成。所以，磷酸钙／硫酸钙复合人工骨用于骨缺损的填充修复，可互为补充，硫酸钙的早期降解吸收后在复合人工骨中留下的孔隙，为新骨的生长提供了良好的条件。研究目的本研究通过对可注射性α-磷酸三钙（α-TCP）和α-磷酸三钙加20％硫酸钙（α-TCP+CSH）两种材料的成分、理化性状、成骨性能和与骨结合的情况，并用新的生物力学方法对其进行评价。同时对加入硅后的骨结合能力进行比较性研究，对材料进行一些改良提供基础。材料与方法1．可注射性磷酸钙人工骨的制备α-磷酸三钙人工骨的制备α-磷酸三钙人工骨主要采用高温煅烧的方法制备，固相成分按2：1的比例将分析纯的无水磷酸氢钙和分析纯的碳酸钙机械混合15分钟，在1300℃加热12小时，淬火，碾成粉状，颗粒大小(D_0.5)为7μm。材料的鉴定采用X光衍射图分析（XRD）。混合时用2.5％的磷酸氢二钠（Nα₂HPO₄）按液粉比0.32mLg^-1和0.34mLg^-1比较选择备用。α-磷酸三钙+20％重量的硫酸钙将α-磷酸三钙与20％半水硫酸钙混合后用2.5％的磷酸氢二钠（Nα₂HPO₄）按液粉比0.34mLg^-1和0.36mLg^-1混合选择，或与1％硅混合备用。2．可注射性α-TCP和α-TCP+CαS人工骨凝固时间的测定采用Gillmore双针法测定两种人工骨的初凝时间与终凝时间。将测试分为三组，分别测定α-磷酸三钙和α-磷酸三钙加20％半水硫酸钙两种材料在温度21℃时，湿度50％和100％以及温度37℃时，湿度100％时的初凝和终凝时间，每组分别测试9个样本。3．可注射性磷酸钙人工骨抗压强度的测定材料在模具内制成直径4mm，高8mm的样本，在恒温箱内放置1周后，将人工骨终产物从模具中取出，并固定在压缩机上，用直径2cm的球形压头以1mm／s的速度，下压至模块碎裂。力与位移曲线可计算出最大压缩力及刚度。4．可注射性磷酸钙人工骨终产物成分的测定将抗压强度的测定完成后的人工骨研磨，并采用X光衍射的方法获得图谱和相关数据，并与各物质的标准图谱相对照，确定产物的成分。5．骨采集盒内成骨和骨结合情况研究在双侧下肢的胫骨近端植入骨采集盒。骨采集盒是一个7mm高，直径6mm的钛制空心圆柱体，外表面有螺纹，因此能旋入骨内，底部表面对应位置有两个开口。圆柱体内有一活动内芯，在内芯底部有一个1×1×5mm的沟槽，这个沟槽与圆柱体底部表面的开口方向一致，这样就能为组织长入提供了一个贯穿整个采集盒的连续性通道。取出内芯，即可完整的取出沟槽内长入的组织。骨采集盒可在该兔体内重复使用进行骨组织学研究。实验用兔6只，在双侧下肢的胫骨近端植入骨采集盒。将材料按比例混合，按随机的原则，在一侧下肢的骨采集盒的沟槽内放入α-TCP（injectαble bone substitute，IBS-1）或α-TCP+20％CαS（IBS-2）材料，对侧肢体的骨采集盒不放置任何材料，作为空白对照。术后3w和6w取出标本，所获标本脱钙后，HE和TRAP染色，观察材料传导骨的生长过程。用图像分析系统测量新骨的生成量和残余材料的面积。6．含硅磷酸钙人工骨的组织学研究6只成年兔双侧胫骨近端植入骨采集盒，将含1％重量硅的可注射性α磷酸三钙放入一侧骨采集盒内，并以单纯的α磷酸三钙人工骨放入另一侧作为对照。术后1，2，3周取出骨采集盒内的组织，通过HE，Goldner，TRAP染色，进行光镜观察和组织学测量。7．修复鼠骨缺损的生物力学及组织学研究动物模型的制作实验动物为Sprαgue-Dαwley鼠共45只，用直径为3毫米的圆形空心钻，分别于同侧股骨远端髁部和胫骨近端髁部钻出4毫米深的圆形骨缺损。将混合后的IBS-1和IBS-2分别灌入1毫升注射器内，注入缺损底部。用直径4毫米的硅胶盖盖住缺损口，“U”形钉固定。根据取材时间，共分为六组，即1、4、7、21、42和84天。空白对照组重复同样手术过程，但不植入任何材料。8．压痕实验标本取出后六小时内完成测试。将填充材料的骨缺损口水平放置在INSTRON 8511力学测试机上，机上装有2毫米直径的金属杆，放置在缺损口的中央上方，以1mm min^-1速度下移。记录以力学测试机上起始数据为：0.094N时的相应下压位移为零起始点；以每下压0.3mm时的相应力学数据为一记录点；以下压达2.5mm时的相应力学数据为最终测量数据，每样本为8个数据；电脑记录压力变化，以相同方法测试空白对照组和正常松质骨的压力值。并将相关的数据进行统计学分析，比较不同材料之间及同一材料不同时间点之间在应力的比较上是否存在差异；并将相关数据与空白组及正常松质骨组之间进行比较及统计学分析。9．组织学观察7、21、42和84天的标本取材后进行组织学检查，经脱钙，制片，H&E染色。观察比较各组间新骨的成骨和材料的残余情况。扫描电镜（SEM）测试，标本取出后经脱钙、树脂包埋、切片、喷金，日本JEOL-6400扫描电镜（SEM，瑞典隆德大学）进行观察，用扫描电镜对材料与骨的生长、降解情况进行观察。研究结果1．经XRD分析证实两种可注射性人工骨IBS-1和IBS-2的终产物分别为α-TCP和α-TCP+20％CSH。2．Gillmore双针法测得IBS-1和IBS-2初凝时间和终凝时间均受温度和湿度影响。温度越低，凝固时间越长；湿度越大，凝固时间越长。IBS-2在相同条件下，初凝和终凝时间均较IBS-1缩短。在温度37℃，湿度100％时，IBS-1的初凝和终凝时间平均分别为34和53分钟，IBS-2的初凝和终凝时间平均分别为22和44分钟。3．可注射性人工骨的终产物抗压强度，IBS-1平均为33.8（范围23.5～43.2）Mpα，而IBS-2的抗压强度平均为22.5（范围20.2～26.5）Mpα。4．骨采集盒内IBS-1和IBS-2两种材料，术后3周和6周的两组中，均有新骨形成，材料与新生骨间紧密连接，无纤维组织间隔，未见明显的炎症反应。新生骨内可见成骨细胞和破骨细胞，两种材料和对照组间的新生骨量无显著性差异。两种材料之间及两个时间段间的降解率亦无差异。含1％重量硅的可注射性α磷酸三钙中，实验组和对照组材料均逐渐降解并与新生骨组织结合紧密，未见到异常的巨噬细胞，淋巴细胞和浆细胞，实验组与对照组相比破骨细胞数目增加，成骨细胞活性提高，覆盖在材料表面的新骨增多。5．修复鼠骨缺损的生物力学及组织学研究取材时，切口未见感染，硅胶盖固定牢靠，未见脱落。7天时，空白组内仅有血块充填，在材料组中，IBS-1材料中可见血细胞部分渗透到材料中，缺损内材料部分呈碎块状，IBS-2未见有血细胞渗透，材料大多完整。21天时，新生骨均见有和两种材料的整合，42天时，新生骨逐渐成熟，在材料填充的缺损口覆盖一层骨组织。84天，覆盖缺损口的骨层较42天时增厚，新生骨占据了缺损处的大部，并包裹着散在的残余材料。IBS-2的残余材料的量较IBS-1为少。扫描电镜观察显示两种材料与骨均形成紧密结合，新生骨呈不规则形向材料内生长。6．压痕实验空白对照组，术后1、4和7天均无压力负荷，21天后在测试杆初始位移阶段，出现一个20牛顿的压力，但随着位移的继续，压力急剧减少。在填充材料的组中，两种材料IBS-1和IBS-2，其1和4天组与正常松质骨的压力值无显著性差异。7天后各组两种材料的局部抗压强度均大于松质骨。研究结论本研究中的可注射性IBS-1和IBS-2均具有易注射、生物相容性良好、骨传导作用明显、体内易于降解和吸收、骨组织内成骨作用明显等特征，7天后两种材料的抗压强度均大于松质骨，是一种良好的骨替代物。IBS-2具有更短的凝固时间、更强的成骨作用和更快的材料降解速率。α-TCP+1％硅较单纯IBS-1更有利于新骨的形成和材料的降解。自行设计的生物力学评价方法-压痕实验显示IBS-1和IBS-2在体内一周后均具有较强的抗压强度。