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对影响RAPD扩增图谱的5个因子:Primer浓度、模板浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量和Mg2+浓度设计了5个水平,再通过正交分析表组建了25个反应体系,然后根据可辨识的电泳条带进行正交实验表中各组结果的统计,建立起小麦白粉病菌的RAPD分析优化体系。结果表明:在试验范围内,5个因子中对扩增结果的影响由大到小依次为Primer浓度、模板浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量和Mg2+浓度。在反应体系中,各项因子最适浓度为:引物浓度2.0μmol/L,模板浓度5ng,dNTPs浓度0.1 mmol/L、Taq酶用量1.5U,Mg2+浓度2.0mmol/L。 在所得的RAPD优化体系的基础上,采用集群分析法(BSA),分别对小麦白粉菌交配型和白化性状进行了多态性分析。结果表明,在520条随机引物中有478条单引物能扩增出条带,占扩增引物总数的92%,扩增片段在300-2000bp之间。对交配型性状,有24个引物或引物组合在DNA池中扩出多态性条带;对白化性状,有15个引物扩出多态性条带,但只有两个RAPD标记,OPQ03775和OPQ09685可能分别与交配型和白化性状相关。将这两个RAPD标记片段克隆,序列分析显示:这两段序列与目前已知的任何序列都没有同源性,且只有OPQ03775有较长的开放式阅读框架。根据克隆片段末端序列设计引物,成功的将RAPD标记转化为更为稳定的SCAR标记。标记OPQ03775能在7个已知交配型菌株中扩增出特异性条带,在由34个野生菌组成的菌群中的出现与否符合1:1的比例,跟交配型分布的理论值一致;标记OPQ09685在白化和正常菌株的43个杂交后代中与白化性状的交换率是25.6%,经软件MAPMAKER3.0计算,遗传距离为15.2cM,表明该标记与白化性状有一定的连锁性。 从大麦白粉菌已克隆的174个基因中调出20个与大麦互作的基因,并从中选取了4个基因:BIG2,大麦诱导表达基因,在侵染初期起调控作用;Car1,过氧化氢酶基因;CLg,与大麦白粉菌的毒力,侵染及附着胞形成相关;gp16,大麦白粉菌萌发蛋白基因。根据基因序列设计特异性引物对小麦白粉菌基因组扩增,只有引物对Cat1p扩出特异性条带。将该片断回收克隆测序,序列分析显示该片段全长669bp,编码172个氨基酸,与大麦白粉菌的相应片段的序列相似性为93%,该区域位于过氧化氢酶功能域编码区。