泥鳅是东亚国家,最重要的经济养殖鱼类之一。随着泥鳅养殖业的快速发展,由病原导致的感染性疾病越来越严重,尤其是细菌性疾病,这给我国的泥鳅养殖户造成了巨大的经济损失。然而,现在对泥鳅抗细菌感染的免疫机制的研究却并不是很多。补体系统是机体很重要的免疫防御系统,而补体C3是补体系统3条激活途径的一个中心分子,这3条激活途径最终都会回归到C3转化酶的形成,和共享最后的终末溶解途径。本论文利用分子克隆的方法对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)补体C3基因进行了克隆与鉴定,构建了补体C3基因的系统进化树,分析了补体C3基因的m RNA在不同组织中的表达水平。并且在此基础上,构建了嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅的模型。用苏木精/伊红染色(HE染色)呈现了皮肤和鳃在感染以后的形态变化规律,用q PCR分析了泥鳅补体C3基因和其它9种补体相关基因在感染以后m RNA的表达规律,并以此构建了基因表达的热图。1.利用实验室已经获得的泥鳅转录组数据库比对分析,经过PCR验证发现了在泥鳅中存在3种C3亚型,分别命名为C3-1、C3-2和C3-3。克隆出了泥鳅C3-1的全长c DNA序列。C3-1 c DNA序列由4509 bp核苷酸组成,预测编码1454个氨基酸。C3-1的氨基酸序列中存在对C3功能非常重要的保守结构域。并且还在C3-1的氨基酸序列中发现典型的硫酯键序列(GCGEQ)存在一个氨基酸的突变。补体C3的系统进化树显示泥鳅补体C3-1与鲤科鱼类的补体C3亲缘关系较近。检测了3种C3亚型mRNA在肾脏、眼睛、脾脏、性腺、心脏、鳍条、肠道、肌肉、大脑、鳃、皮肤、血液和肝脏中的表达情况。发现C3-1和C3-3的表达模式类似,主要在肝脏中表达,然后是脾脏和性腺。然而,C3-2 m RNA的表达却与C3-1和C3-3有所不同。C3-2主要在肾脏中表达,然后是血液和性腺。2.用1×10~7CFU/ml的嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到嗜水气单胞菌浸泡感染以后,它的皮肤和鳃会有一个很明显的形态变化。与对照组相比,泥鳅的次级鳃丝会变得又短又宽,而皮肤的表皮层也会有一个明显的变宽。3.用1×10~7CFU/ml的嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到嗜水气单胞菌浸泡感染以后,C3-1和C3-3基因的m RNA的表达规律在鳃和皮肤中类似,分别在鳃的36 h和皮肤的24 h有一个显著的上调表达。而C3-2在鳃和皮肤中达到上调表达峰值的时间点都是感染以后48 h。在感染以后,3种C3亚型m RNA的表达在肝脏和脾脏中的表达都呈现出了一个很明显的上调趋势。同样的,我们也检测了一些补体调控相关的基因表达,BF、C1qb、C2b、C3aR、C3b、C4、C5、C8b和MASP-1。发现大多数补体相关基因的表达在鳃、皮肤和肝脏中也出现了一个上调的趋势,只是上调的倍数有所差异。本研究是第一次在泥鳅中报道存在3种C3亚型,并且首次克隆出了泥鳅补体C3-1的全长c DNA序列。3种C3亚型在许多组织中都有所表达,只是表达水平有所差异。泥鳅在受到嗜水气单胞菌感染以后,皮肤和鳃会有一个很明显的形态变化。而感染实验也可以造成3种C3亚型和其它补体基因在鳃,皮肤和肝脏中的表达上调。综上所述,我们的研究暗示着补体C3可能在黏膜组织抗细菌感染的过程中,发挥了一个重要的作用。本研究的结果同样也可以为后续补体C3的功能研究提供一个很坚实的基础。