拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，简称青蟹，是我国重要的经济蟹类之一，广泛分布于我国的东海和南海等海域。近年来，伴随着蟹类养殖规模的扩大以及其集约化养殖的发展，各种养殖病害频发严重制约了蟹类养殖产业的发展。青蟹凭借其独特的先天性免疫系统，在外界不良生存环境中有效地抵御外界病原菌的入侵，因而其先天免疫防御机制的研究备受关注。　　甲壳肽(Crustin)是甲壳动物免疫系统的重要效应分子，本研究我们从青蟹中鉴定了3个甲壳肽基因，分别命名为SpCrus3、SpCrus4和SpCrus5。当前文献报道将甲壳肽分为5类，在Ⅰ型甲壳肽中，信号肽序列和WAP结构域之间含一个半胱氨酸富含区。通过对获得的SpCrus3和SpCrus4序列进行分析，我们发现这两个分子均属于Ⅰ型甲壳肽，并且这两个基因的cDNA序列含有相同的5端。表达模式分析显示:SpCrus3和SpCrus4主要在鳃中表达;在副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后，SpCrus4上调表达，而SpCrus3下调表达。虽然SpCrus3和SpCrus4具有66.06％的相似性，但SpCrus4的抗菌活性强于SpCrus3。微生物结合实验表明SpCrus3和SpCrus4对所有受试微生物均具有结合活性。多糖结合实验表明这两个蛋白对细菌多糖如脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN)都具有结合活性，并且SpCrus3和SpCrus4对LPS和LTA的结合活性强于PGN。此外，SpCrus4对LTA的结合活性强于SpCrus3，这可能是这两个蛋白之间抗菌活性呈现显著差异的原因。凝集实验表明SpCrus4对微生物的凝集活性强于SpCrus3，这种增强的凝集活性可能有助于SpCrus4表现出更强的抗菌活性。基于以上结果，我们提出了SpCrus3和SpCrus4参与青蟹抗菌免疫的模型:SpCrus3在健康的青蟹中高度表达以保持低水平的抗菌活性;当细菌感染青蟹时，诱导产生大量的SpCrus4表现出对细菌更强的抗菌活性。　　根据当前分类标准，Ⅱ型甲壳肽在N端邻近信号肽区有一段较长的富含甘氨酸的疏水区域(GRR)和一个半胱氨酸富含区，同时在C端含有一个WAP结构域。GRR结构域是区分Ⅰ型和Ⅱ型甲壳肽的主要标记基序，并且一些研究表明含有GRR的Ⅱ型甲壳肽比Ⅰ型甲壳肽具有更广泛的抗菌谱。我们发现SpCrus5序列的C端含有一个GRR结构域，这与经典的Ⅱ型甲壳肽的含有N端GRRs结构域不同。表达模式分析显示:SpCrus5主要在鳃中表达:在副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后，SpCrus5上调表达，表明SpCrus5可能参与抗菌免疫反应。为了进一步阐明这种C端GRR结构域是否影响SpCrus5的功能，我们通过删除GRR结构域获得了GRR缺失突变体(SpCrus5-ΔGRR)。SpCrus5成熟蛋白的抗菌活性强于SpCrus5-ΔGRR，前者对革兰氏阴性菌的抗菌谱也广于后者;SpCrus5蛋白对微生物细胞的结合活性和多糖结合活性强于SpCrus5-ΔGRR;SpCrus5和SpCms5-ΔGRR凝集所有受试的革兰氏阳性菌。上述实验表明，SpCrus5对微生物多糖的结合活性以及对微生物的凝集活性有助于发挥其抗菌活性，并且其C端GRR结构域能够增强SpCrus5的抗菌活性并拓宽其抗菌谱。虽然根据经典分类方法，SpCrus5属于Ⅰ型甲壳肽，但SpCrus5与大多数Ⅱ型甲壳肽具有高度相似性并且其功能与一些Ⅱ型甲壳肽相似，表明SpCrus5更像一个非经典的Ⅱ型甲壳肽。　　综上所述，本研究对青蟹中3个甲壳肽基因进行了表达模式及免疫功能研究，发现SpCrus3、SpCrus4和SpCrus5是青蟹免疫体系中的重要抗菌蛋白，它们以不同的方式参与青蟹免疫反应。本研究为了解甲壳肽序列和功能多样性、抗菌机制以及多个甲壳肽如何协作提供免疫保护提供了新的见解。