【摘 要】
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随着经济的发展和时代的进步,人们生活方式发生改变,非酒精性脂肪肝病（NAFLD）成为慢性肝损伤的一种常见形式。NAFLD在某种程度上,可谓是一种生活方式病,其疾病谱包括从脂肪变性演变为脂肪性肝炎,肝硬化到肝细胞癌。研究表明NAFLD与胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病和肥胖等代谢综合征存在密切关系。研究发现甘油-3-磷酸酰基转移酶-4（GPAT4）在小鼠脂肪组织和肝脏中高表达,并具有参与TAG合成的作
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随着经济的发展和时代的进步,人们生活方式发生改变,非酒精性脂肪肝病（NAFLD）成为慢性肝损伤的一种常见形式。NAFLD在某种程度上,可谓是一种生活方式病,其疾病谱包括从脂肪变性演变为脂肪性肝炎,肝硬化到肝细胞癌。研究表明NAFLD与胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病和肥胖等代谢综合征存在密切关系。研究发现甘油-3-磷酸酰基转移酶-4（GPAT4）在小鼠脂肪组织和肝脏中高表达,并具有参与TAG合成的作用,通过基因过表达和基因敲除实验证实GPAT4对肥胖、肝脏脂肪变性和IR的发生发展中具有重要作用。GPAT4定位于内质网,参与内质网脂质的合成。相关研究证实内质网应激是IR和NAFLED的可能发病机制之一。为进一步探究IR和NAFLD发病与GPAT4之间是否存在着关联,本研究应用GPAT4肝脏特异敲除小鼠（GPAT4Liver-specific Knockout,GPAT4-LKO）,观察D09100301饲料（富含反式脂肪酸的特殊高脂饮食）喂养的特异敲除小鼠和未敲除小鼠代谢表型的差异,并通过检测内质网应激（ERS）相关信号分子探讨可能的作用机制,加深我们对IR及NAFLD发病机制的认识,为将来研发治疗药物提供理论依据实验目的:探讨肝脏GPAT4在饮食诱导小鼠肝脂肪变性与IR发病机制中的作用。实验方法:1.基因敲除模型的建立及鉴定:首先利用Cre/lox P重组酶系统,建立GPAT4的肝脏特异性基因敲除小鼠模型,肝脏中GPAT4敲除的特异性和敲除效率通过基因分型实验、定量实时PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）三重验证;2.饮食诱导模型的建立:挑选6周龄雌雄GPAT4小鼠为实验组（GPAT4-LKO组,n=10）并且以带有GPAT4基因loxp标记的同窝flox小鼠为对照组（GPAT4-FLOX组,n=10）,喂食D09100301饲料（40%脂肪其中30%反式脂肪酸、20%果糖、2%胆固醇）,诱导小鼠IR和NAFLD模型的建立;3.代谢及ERS指标的检测:GPAT4-LKO组与GPAT4-FLOX组的小鼠在喂养特殊饮食的第10周进行糖耐量实验,第12周后收集血清并测试胰岛素、血脂、肝脂质及肝功能指标,肝组织进行油红O和HE染色对比进行病理评估,通过qPCR实验检测肝细胞的内质网应激指标。实验结果:1.喂食D09100301饮食12周,每周GPAT4-LKO组和GPAT4-FLOX组小鼠的体重对比无明显差异,内脏脂肪未见明显存储;与GPAT4-FLOX组比较,GPAT4-LKO组小鼠空腹血糖、葡萄糖耐量实验血糖和HOMA-IR指数均显著降低（P<0.05或P<0.01）。2.与GPAT4-FLOX组相比,GPAT4-LKO组肝脏溶血磷脂酸（LPA）、甘油二酯（DAG）、甘油三酯（TAG）的含量显著降低（P<0.05或P<0.01）。在雌性小鼠,GPAT4-LKO小鼠肝脏LPA、DAG、TAG含量比GPAT4-FLOX小鼠分别降低17.16%、8.09%、11.55%,;而在雄性小鼠,GPAT4-LKO组比GPAT4-FLOX组LPA、DAG、TAG含量低比率为24.68%、16.08%、18.11%;GPAT4-LKO组小鼠肝损伤程度比GPAT4-FLOX组较低,AST指标存在显著差异（GPAT4-LKO组vs GPAT4-FLOX组:214.92 vs 369.97 IU/L,P<0.05）;肝脏病理切片可见GPAT4-FLOX组小鼠肝脏明显的气球样变性、炎症细胞浸润。收集组织过程中发现,GPAT4-FLOX组6只（6/10）小鼠出现黄疸、脾大等症状。3.qPCR检测两组内质网应激的三条信号通路信号分子的mRNA表达,与GPAT4-FLOX相比,GPAT4-LKO组肝脏GRP78、CHOP、ATF6、XBP-1、eIF2α、ATF4的mRNA表达均有显著降低（P<0.05）。结论:1.D09100301饮食可以诱导小鼠出现肝脂肪变性和IR,敲除肝脏GPAT4明显改善饮食诱导的小鼠高血糖和胰岛素抵抗状态,减轻肝脂肪变性。2.敲除肝脏GPAT4有效减轻小鼠饮食诱导的NAFLD和IR的机制可能与下调肝脏ERS有关。
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