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miR-144和miR-451是一个双顺反子miRNA基因位点。miR-451的表达量约占据红细胞发育晚期miRNA的50%。大量体内外实验结果发现,miR-144/451在红细胞发育成熟过程中和珠蛋白合成过程中起到至关重要的作用。β地中海贫血患者的前体红细胞中miR-451的表达明显增高,miR-144/451参与β地中海贫血的发生发展,那么我们猜想miR-144/451是否也在其他类型的贫血中发挥着重要的作用呢?主要进行以下实验:1)建立缺铁性动物模型、慢性失血性贫血动物模型、和注射苯肼致溶血性贫血动物模型;2)检测miR-144/451在各种贫血模型中的外周血、骨髓以及小鼠胚胎肝红细胞中表达趋势;3)研究分析miR-144/451在贫血动物模型中表达增高的分子机制及其临床意义。通过以上实验,本研究旨在明确miR-144/451与除β地中海贫血以外的其他类型贫血的关系,阐明miR-144/451与贫血关系的可能分子机制。1.三种小鼠贫血模型的建立及其miR-144/451的表达目的:通过物理、化学等方法建立小鼠贫血模型,观察缺铁性贫血小鼠的精神状态,皮肤黏膜情况等,用于研究缺铁性贫血状态下miR-144/451表达情况。方法:1)21天大小的C57BL/6小鼠(断奶小鼠)用缺铁性饲料(购自南通特洛菲饲料科技有限公司Trophic Animal Feed High-Tech Co.,Ltd,China)饲养,并且在缺铁性饲料饲养小鼠期间同时喂食超纯水以避免水中铁元素对实验结果的影响。然后在饲养缺铁饲料后的第4-5周目内眦采集小鼠外周血检测,记录相关指标变化,检测小鼠贫血程度。并提取小鼠外周血红细胞中的总RNA,进行反转录成cDNA,并运用qRT-PCR技术检测miR-144和miR-451的表达情况。2)C57BL/6小鼠通过腹腔注射浓度为65mg/kg的苯肼溶液,于注射前和注射后的1,2,3,4,5,6,7天目内眦采集小鼠外周血检测,记录相关指标变化,检测小鼠贫血程度。并提取小鼠外周血红细胞中的总RNA,进行反转录成cDNA,并运用qRT-PCR技术检测miR-144和miR-451的表达情况。3)每两天为C57BL/6小鼠目内眦放血一次,每次放200μl,连续放血6次。在最后一次放血后,目内眦采集小鼠外周血检测,记录相关指标变化,检测小鼠贫血程度。并提取小鼠外周血红细胞中的总RNA,进行反转录成cDNA,并运用qRT-PCR技术检测miR-144和miR-451的表达情况。结果:小鼠出现贫血症状,各组小鼠的皮肤和粘膜颜色苍白,外周血红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞压积降低,网织红细胞比例增高,小鼠表现为贫血状态。取小鼠外周血并提取其RNA检测其miR-144/451的表达,miR-144/451的表达增高。结论:建立了小鼠贫血模型,可以为用于检测miR-144/451表达情况的实验。贫血状态下miR-144/451的表达增高说明miR-144/451可能参与贫血的发生发展。2.临床缺铁性贫血、肿瘤贫血样本miR-144/451的表达目的:明确miR-144/451在临床缺铁性贫血、肿瘤贫血样本中的表达,为进一步探讨miR-144/451与贫血的关系及其机制研究提供支持。方法:收集临床缺铁性贫血样本、肿瘤贫血病人血样本和再生障碍性贫血样本。并且提取红细胞中的总RNA,进行反转录成cDNA,并运用qRT-PCR技术检测miR-144和miR-451的表达情况。结果:临床缺铁性贫血、肿瘤贫血病人血样本红细胞中miR-144/451的表达增高,但是再生障碍性贫血病人血样本中红细胞miR-144的表达无明显变化而miR-451表达减低。结论:临床缺铁性贫血、肿瘤贫血病人血样本红细胞中miR-144/451的表达增高说明miR-144/451可能参与病人缺铁性贫血和肿瘤贫血病人贫血过程的发生发展,并且其作用机制不同于再生障碍性贫血疾病。3.miR144/451在贫血过程中的功能研究目的:利用上述建造的小鼠贫血模型和临床贫血样本中miR-144/451在红细胞中的表达情况。通过相同条件同时处理miR-144/451敲除小鼠和野生型小鼠,观察两种类型小鼠贫血情况。探究miR-144/451在贫血过程中的功能。方法:利用上述方法同时处理相同年龄,相同性别的miR-144/451敲除小鼠和野生型小鼠,检测两种小鼠外周血常规变化情况;制作外周血涂片,并进行瑞氏-吉姆萨染色明确小鼠外周血中红细胞形态、数量变化;运用流式细胞技术检测小鼠外周血和骨髓中的红细胞,明确红细胞的分化成熟度;运用流式细胞仪检测外周血中网织红细胞数量,明确红细胞成熟度;检测小鼠脾脏的形态学及组织学变化,明确各组小鼠的代偿性造血水平;磁珠分选小鼠骨髓有核红细胞WB检测GATA1表达;qRT-PCR检测小鼠骨髓有核红细胞中抗氧化应激酶包括SOD、Catalase、GPX1、NQO1的表达变化。结果:1)外周血涂片瑞氏-吉姆萨染色结果提示:与贫血处理过的wt组小鼠比较,miR144/451敲除组小鼠外周血红细胞形态并改善,红细胞大小不均匀,细胞破碎,中心淡染区增大,网织红细胞计数明显增多;2)流式细胞仪检测结果提示:与贫血处理过的wt组小鼠比较,miR-144/451敲除组小鼠的外周血中网织红细胞比例增加,且骨髓及外周血的红细胞成熟度减低;3)脾脏形态学及组织学结果提示:与贫血处理过的wt组小鼠比较,miR-144/451敲除组小鼠的脾脏偏大,重量增大,提示小鼠体内代偿性造血功能减弱;与未处理过的wt组小鼠相比,处理过的贫血wt小鼠GATA1表达增高,抗氧化酶表达量下降。结论:1)miR-144/451敲除小鼠和经处理过的wt贫血小鼠体内的氧化应激水平增加;2)由于经处理过的wt贫血小鼠miR-144/451表达增高,而对miR-144/451敲除小鼠经过相同条件处理后,贫血情况并未改善反而加重,说明了在外源性刺激下小鼠贫血的发生受其他机制的调控作用更加明显。