牙齿的发生和发育是由釉质形成所需的牙源性上皮细胞和形成牙髓牙本质复合体的牙源性间充质细胞共同来完成。因此牙齿的再生必须要有两种细胞:上皮和间充质细胞。组织工程化牙齿研究的关键在于:获取来源丰富且具有成牙潜能的种子细胞,使其在适宜的成牙微环境下发育、分化。由于牙源性种子细胞的难以获得,所以寻找合适的的成体干细胞作为种子细胞是再生研究的重要目标。人牙龈成纤维细胞是口腔粘膜牙龈组织的主要细胞,在牙龈、牙周组织的生理和病理中起重要作用。这种细胞来源丰富,有很强的生长和自我繁殖能力。依据真皮组织干细胞的研究进展情况来看,由于口腔粘膜与皮肤类似所以提示研究者在口腔粘膜中也应该含有类似的成体干细胞存在。因成体干细胞具有可塑性,如能从牙龈固有层中分离出间充质干细胞,将非牙源性成体干细胞诱导分化为牙源性细胞,将为组织工程牙齿的构建提供新的种子细胞来源。本研究采用组织块和胰酶消化法原代培养人牙龈间充质干细胞、牙周膜干细胞和真皮干细胞,并对牙龈间充质干细胞生物学特性进行鉴定。在此基础上利用SD大鼠发育早期的牙胚条件培养液来诱导牙龈间充质干细胞向特定方向分化的可能性,探讨牙龈间充质干细胞向牙源性间充质细胞分化的能力。为筛选和诱导组织工程牙齿种子细胞提供研究参考。取得的主要研究结果如下:1.牙龈间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性的研究经患者/监护人同意后取临床上导萌术或者智齿拔出时切下的牙龈采用组织块和胰酶消化法进行牙龈间充质干细胞原代培养。利用磁珠分选法和有限稀释法对原代培养的牙龈间充质细胞进行筛选纯化,将克隆形成的细胞在倒置显微镜下观察其形态及生长状况。对筛选细胞的增殖能力、细胞表型以及细胞周期的特性进行分析。结果显示所培养的牙龈间充质干细胞的形态多为长梭形,为典型的成纤维细胞形态。使用流式细胞仪检测牙龈间充质干细胞表型,结果显示对于间充质干细胞的标志物CD29、CD90分别有99.8%和99.4%的表达阳性。说明了我们获取的细胞具有间充质干细胞生物学特性。与此同时对于CD34和CD45的低表达也表明我们培养的牙龈纤维来源的间充质干细胞为非造血系来源细胞。牙龈间充质干细胞具有克隆形成能力,生长状态稳定,经诱导后有成骨和成脂肪能力。流式细胞周期分析显示所培养的细胞多数处于G0/G1期。免疫化学检测间充质干细胞标志物CD105、CD146、STOR-1细胞均呈阳性表达;增殖细胞核抗原Ki67,多数细胞呈阳性且增殖旺盛。由此看来确定所分离细胞为间充质干细胞。2.牙龈固有层间充质干细胞与牙周膜、真皮干细胞的生物学特性比较.为进一步探讨牙龈固有层间充质干细胞的生物学特性,我们对人牙龈间充质干细胞、牙周膜干细胞和真皮干细胞采用组织块法进行原代培养。绘制生长曲线,测定三者碱性磷酸酶活性;使用流式细胞术检测三种细胞的表面分子表达、细胞增殖检测(MTT、细胞周期分析)、多向分化(成脂、成骨)能力检测、RT-PCR检测。观察对比三种细胞其形态、生长方式、增殖能力等生物学特性的异同。结果显示,光镜下观察三种细胞在形态和结构上相似。牙龈间充质干细胞原代培养成功率及细胞增殖能力明显高于牙周膜干细胞但低于真皮干细胞。流式细胞术在检测三种干细胞的表面分子CD90、CD105表达中,牙龈间充质干细胞表达最高。在PCR检测中牙周膜干细胞、牙龈间充质干细胞的I型胶原表达强于真皮干细胞,Ⅲ型胶原表达牙周膜干细胞最强,真皮干细胞其次,牙龈间充质干细胞表达最弱。牙龈间充质细胞的ALP水平明显高于真皮干细胞,但低于牙周膜干细胞。成脂、成骨多向分化能力检测中牙周膜干细胞>牙龈间充质干细胞>真皮干细胞。结论:牙周膜干细胞具有较强的成骨能力,是理想的牙齿组织工程的种子细胞。牙龈间充质干细胞成脂成骨能力优于真皮干细胞易于培养成活,增殖力强,具有牙周膜干细胞的一些特点,也可考虑作为牙齿组织工程的种子细胞。3.牙胚条件培养基对牙龈间充质干细胞牙向分化的体外诱导研究以牙胚细胞条件培养液为辅助诱导液对牙龈间充质干细胞提供成牙微环境,诱导牙龈间充质干细胞进行牙向分化诱导。结果表明,牙龈间充质干细胞经过体外一段时间的牙胚条件培养基诱导后,细胞增殖能力变强;牙龈间充质干细胞诱导后RT-PCR能够表达DMP-1、BSP、OPN、ALP。免疫荧光染色显示牙相关DMP-1。牙胚细胞条件液不仅可上调牙龈间充质干细胞的增殖活性,还可促进其细胞外基质的分泌,形成矿化结节。该实验为寻找非牙源性间充质细胞替代牙源性间充质细胞的研究奠定了实验基础。本研究结果显示,牙胚条件培养基能够促使牙龈间充质干细胞在体外向牙源性间充质细胞方向分化。