论文部分内容阅读
第一部分西达本胺对CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白乙酰化和细胞活化影响的体外研究目的:组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)能提高细胞组蛋白乙酰化水平。在组蛋白高乙酰化水平下,静息CD4+T细胞中HIV-1病毒储存库的基因表达增加,进而可能激活HIV-1病毒储存库,最终实现清除HIV-1病毒储存库实现艾滋病功能性治愈。西达本胺属于中国自主研发的国际首个口服剂型的亚型选择性HDACi。西达本胺在提高CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白乙酰化水平过程中,是否会引起CD4+T细胞和CD8+T细胞活化指标相关基因表达增加,进而导致其细胞活化?而CD4+T细胞和CD8+T细胞的异常活化可能促进HIV-1感染以及导致CD4+T细胞易耗竭而产生细胞毒性反应。评价西达本胺对HIV-1感染者CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白乙酰化和细胞活化的影响是其用于激活HIV-1病毒储存库,实现艾滋病功能性治愈的前提。方法:(1)分离培养6例抗反转录病毒治疗后血浆HIV-1 RNA小于20 copies/mL的HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)。(2)同一例HIV-1感染者PBMC均以自身作为对照设置实验组和对照组,实验组分别加入不同浓度西达本胺(500 nmol/L、1000 nmol/L、1500nmol/L 和 2000nmol/L),对照组加入0.02%DMSO。(3)用流式细胞术检测0h、药物作用后24 h和72 h不同时间点PBMC中CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白H3和H4乙酰化。(4)用流式细胞术检测0h、药物作用后24 h和72 h不同时间点PBMC中CD4+T细胞和CD8+T细胞活化指标(CD69、CD38和HLA-DR)。(5)MTT法检测药物作用后24 h、48 h和72 h不同时间点的细胞存活率。结果:(1)不同浓度西达本胺(500 nmol/L、1000 nmol/L、1500 nmol/L和2000 nmol/L)体外作用于PBMC 24 h和72 h分别与相同时间点对照组比较,均能明显提高CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平(P<0.05);但实验组中,不同浓度西达本胺分别提高CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平的差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)不同浓度西达本胺(500 nmol/L、1000 nmol/L、1500 nmol/L 和 2000 nmol/L)体外作用于PBMC 24 h和72 h,均未引起CD4+T细胞活化指标(CD69、CD38和HLA-DR)表达百分比明显改变(P>0.05);但72 h时,在1500 nmol/L西达本胺实验组和2000 nmol/L西达本胺实验组中,CD8+T细胞活化指标CD38和HLA-DR表达百分比较72 h相同时间点的对照组高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)500 nmol/L西达本胺作用于PBMC 24 h、48 h和72 h,其细胞存活率均大于90%,且各时间点细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)西达本胺在体外可能具有激活CD4+T细胞中HIV-1病毒储存库的能力。(2)500nmol/L西达本胺在体外对CD4+T细胞和CD8+T细胞不会产生异常免疫活化的毒性作用。第二部分西达本胺激活PBMC中HIV-1病毒储存库的体外研究目的:不同浓度(500 nmol/L、1000 nmol/L、1500 nmol/L 和 2000 nmol/L)西达本胺在体外能提高HIV-1感染者CD4+T细胞和CD8+T细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平,但500 nmol/L西达本胺在体外不会导致CD4+T细胞和CD8+T细胞异常免疫活化且对细胞毒性相对较小。因而,500 nmol/L西达本胺在体外不仅具有潜在激活HIV-1病毒储存库的能力,并具有相对较好的安全性。但西达本胺在体外是否也能有效提高HIV-1感染者PBMC组蛋白乙酰化水平,进而激活PBMC中HIV-1病毒储存库?在本部分研究中,我们将扩大样本量,加用更低浓度(250 noml/L)的西达本胺,进一步探索西达本胺在体外是否能有效提高HIV-1感染者PBMC组蛋白H3和H4乙酰化水平,并探索西达本胺在体外引起PBMC组蛋白高乙酰化水平下,是否会激活PBMC中HIV-1病毒储存库,从而为西达本胺进一步用于激活HIV-1病毒储存库的体内研究提供重要依据。方法:(1)分离培养20例抗反转录病毒治疗后血浆HIV-1 RNA小于20 copies/mL 的HIV-1 感染者 PBMC。(2)同一例HIV-1 感染者 PBMC 均以自身作为对照设置实验组和对照组,实验组分别加入250 nmol/L西达本胺和500 nmol/L西达本胺,对照组加入0.02%DMSO。(3)用流式细胞术检测0 h和药物作用后72 h不同时间点PBMC组蛋白H3和H4乙酰化。(4)用PCR-荧光探针法检测药物作用后72 h PBMC中HIV-1 DNA。结果:(1)250 nmol/L西达本胺和500 nmol/L西达本胺体外作用于HIV-1感染者PBMC 72 h,各实验组分别与72 h对照组比较,均可以提高PBMC组蛋白H3和H4乙酰化水平,且差异具有统计学意义(P<0.05);但实验组中,不同浓度西达本胺分别提高PBMC组蛋白H3和H4乙酰化水平的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)250 nmol/L西达本胺和500 nmol/L西达本胺体外作用于HIV-1感染者PBMC 72 h,各实验组与对照组相比,在250 nmol/L西达本胺实验组中,有10例(50%)HIV-1感染者PBMC中HIV-1 DNA出现下降;在500 nmol/L西达本胺实验组中,有11例(55%)HIV-1感染者PBMC中HIV-1 DNA出现下降。PBMC中HIV-1 DNA下降例数百分比在500 nmol/L西达本胺实验组高于250 nmol/L西达本胺实验组,但两组间差异无统计学意义(P=1.000)。结论:西达本胺在体外可能具有激活和减少PBMC中HIV-1病毒储存库的作用。第三部分西达本胺激活PBMC和静息CD4+T细胞中HIV-1病毒储存库的体内研究目的:西达本胺在体外提高HIV-1感染者PBMC组蛋白H3和H4乙酰化水平过程中,可能具有激活和减少PBMC中HIV-1病毒储存库的作用。目前尚不明确西达本胺是否能在HIV-1感染者体内提高细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平,进而在体内激活HIV-1病毒储存库。评价西达本胺在HIV-1感染者体内的上述作用,以及西达本胺在体内对HIV-1感染者病毒学和免疫学指标的影响是实现艾滋病功能性治愈的关键。本部分研究将为西达本胺在体内最终用于艾滋病功能性治愈提供理论依据和技术支撑。方法:(1)筛选出抗反转录病毒治疗后血浆HIV-1 RNA<20 copies/mL的HIV-1感染者14例。(2)按照1:1随机分入西达本胺实验组或安慰剂对照组,每组各7例。(3)西达本胺实验组:在目前抗反转录病毒治疗基础上加用12 w西达本胺治疗;安慰剂对照组:在目前抗反转录病毒治疗基础上加用12 w安慰剂治疗。(4)两组研究对象分别按相应随访点(0w、4 w、8 w、12 w、16 w和24 w)定期检测相关临床指标和实验室指标。结果:(1)HIV-1感染者PBMC和CD4+T细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平在西达本胺实验组中较安慰剂对照组增高的程度更明显。(2)在西达本胺实验组中,8w和16w随访点的静息CD4+T细胞中HIV-1 DNA低于Ow(基线)随访点,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)中央记忆型CD4+T细胞在西达本胺实验组中较安慰剂对照组有降低的趋势。(4)CD4+T细胞辅助受体CXCR4在西达本胺实验组中较安慰剂对照组有降低的趋势。(5)西达本胺在体内对HIV-1感染者血浆HIV-1 RNA、CD4+T细胞辅助受体CCR5、CD4+T细胞抑制分子(CTLA-4、PD-1和TIM-3)、CD4+T细胞和CD8+T细胞活化指标(CD69、CD38和HLA-DR)以及Treg细胞影响较小。结论:(1)西达本胺在体内可能具有激活和减少静息CD4+T细胞中HIV-1病毒储存库的作用。(2)检测静息CD4+T细胞中HIV-1病毒储存库较检测PBMC中HIV-1病毒储存库更为敏感和特异。(3)西达本胺在体内激活HIV-1病毒储存库的同时,对T细胞不产生异常免疫活化或免疫抑制的毒性作用。