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目的:外泌体以及单链核酸与多种疾病,尤其是癌症的发病机理密切相关。因此,快速,灵敏的外泌体以及单链核酸检测对疾病的诊断和预后具有重要意义。方法:1.基于CD63适配体和CRISPR-Cas12a系统的外泌体检测方法主要包括基于CD63适配体的外泌体膜蛋白识别和基于CRISPR-Cas12a的信号放大两个部分。我们首先在CD63适配体的基础上设计了外泌体捕获探针,负责将外泌体的数量转换为核酸检测,而CRISPR-Cas12a则负责高特异性核酸信号的扩增。随后我们优化了该方法的检测条件,并验证了其在外泌体检测中的应用。2.在构建的单链核酸检测平台中,我们首先采用单链DNA结合蛋白(SSB)将EXPAR非特异性扩增延长至特异性扩增后20min,而后在此阶段引入CRISPR-Cas12a共同构建了超灵敏单链核酸检测平台。此方法通过巧妙的设计确保较高高特异性,同时又能保持出色的灵敏度。结果:1.最终,所建立方法的外泌体检测范围被确定为3×10~3-6×10~7颗粒/μL。此外,我们成功地将该方法用于检测健康人和非小细胞肺癌患者临床血液样本中的外泌体,其结果与NTA技术高度一致。2.使用SSB,我们成功将EXPAR非特异性扩增推迟了20分钟。与此同时,我们在EXPAR靶标特异性扩增10分钟后引入CRISPR-Cas系统。由于CRISPR-Cas12a在识别EXPAR扩增产物后被触发的“旁切”特性可在8分钟内完成第二次信号放大,因此在这个方法中,EXPAR非特异性扩增尚未开始时,即可完成单链核酸的检测,避免了EXPAR非特异性扩增的干扰。这种双重扩增使我们所构建的方法展现出极高的检测灵敏度,最终获得19 aM的检测下限。结论:CRISPR-Cas系统不仅在核酸检测方面具有非常高的应用价值,在其他生物标志物的检测中同样具有非常广阔的应用前景,有望构建成为一种潜在的通用型分子检测平台,可用于多种疾病的筛查,诊断和预后预测。