论文部分内容阅读
研究目的:1.建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、扩增方法,为下一步研究奠定基础。2.判断重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin对IBMSCs的转染效率、转染对细胞的影响以及目的蛋白的表达情况。3.对比观察化学诱导剂、NGF和/或Noggin对rBMSCs向神经元样细胞方向分化的诱导作用。4.探讨携带NGF和/或Noggin的rBMSCs对MCAO动物模型神经功能的修复作用及其机制。研究方法:1.取SD大鼠长骨骨髓作为供体来源,经贴壁筛选法进行体外培养并纯化rBMSCs。通过细胞表面标志、成骨细胞诱导和成脂细胞诱导分化鉴定获得的细胞为高纯度的BMSC。2.通过重组腺病毒的浓度梯度选择转染最适MOI值。将rBMSCs分5组,分别为未转染组、Ad-GFP转染组、Ad-GFP-NGF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组和Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin联合转染组。通过MTT法判断转染对rBMSCs的影响,免疫荧光和Western blot检测目的蛋白的表达情况。3.通过化学诱导剂和基因修饰诱导rBMSCs向神经元样细胞方向分化,并检测其神经细胞标志蛋白的表达。4.线栓法制作大鼠MCAO模型。造模后5天,经股静脉移植入各种基因修饰的BMSC。mNSS评分观察动物神经功能恢复情况,免疫荧光染色检测移植细胞在脑内存活、分布以及向神经元、星形胶质细胞分化情况,免疫组化方法检测移植后缺血周边脑组织中VEGF和突触素表达情况。结果:1.贴壁筛选法获得的细胞具有rBMSCs表型,能向成骨细胞和脂肪细胞分化,并且经反复贴壁传代能获得纯度较高,活性良好的rBMSCs。2.重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin在MOI=50pfu/cell条件下对rBMSCs转染效率高,对rBMSCs毒性最小。经重组腺病毒转染后的BMSC能发出绿色荧光,未转染组和Ad-GFP转染组少量表达NGF,不表达Noggin。Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin分别转染rBMSCs后经相应蛋白免疫荧光染色呈现红色荧光,Western blot显示各转染组rBMSCs在相应蛋白分子量处出现蛋白条带。联合转染组rBMSCs同时呈现NGF、Noggin免疫荧光阳性反应,Westernblot在26、140处同时出现蛋白条带。3.rBMSCs经化学诱导剂诱导5h后出现神经元样形态,免疫荧光染色显示神经元标志物NF(H)呈阳性,星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性,但48h后细胞全部死亡。各转染组rBMSCs中Ad-GFP转染组细胞形态无改变,Ad-GFP-NGF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组及联合转染组rBMSCs在转染后24h呈现神经元样形态,部分细胞免疫荧光染色呈NF(H)阳性,GFAP阴性,并且分化后神经元样细胞可大量增殖,长期存活。其中联合转染组NF(H)阳性率最高。4.线栓法制作的大鼠MCAO模型梗塞对侧肢体瘫痪,TTC染色梗塞区不着色,HE染色呈缺血性病理改变。携带不同基因的rBMSCs静脉移植3w后各组动物神经功能均有不同程度改善,其中联合转染组mNSS评分最低。移植后3w梗塞周边有移植细胞存活,免疫荧光检测部分存活移植细胞为NF(H)阳性,另有部分细胞为GFAP阳性。其中联合移植组存活细胞最多,NF(H)阳性和GFAP阳性细胞比例最大。而各细胞移植组中GFAP+/GFP+细胞比例均高于NF(H)+/GFP+细胞比例。细胞移植后3w,各移植组梗塞周边脑组织VEGF和突触素表达均较未移植组和PBS注射组高,而联合移植组中两者的表达最明显。结论:1.通过贴壁筛选法能有效纯化骨髓,获得高纯度rBMSCs,并且该方法简单实用,对细胞活性影响小,能满足大多数研究需求。通过流式细胞技术检测细胞表面标志,以及成骨、成脂诱导,能够对rBMSCs进行有效鉴定。2.重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin均能安全转染体外培养的大鼠rBMSCs,并持续、高效表达GFP、NGF和Noggin蛋白。Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin联合移植rBMSCs的方法安全、有效。3.体外环境下,化学诱导剂和NGF、Noggin蛋白都能将rBMSCs诱导成为神经元样细胞,但化学诱导剂对细胞存活有明显影响,而后两者可促进细胞增殖和存活,并且两种基因同时表达可进一步促进rBMSCs向神经元样细胞方向分化。4.线栓法制作大鼠MCAO模型能有效模拟人类脑梗塞的病理改变。静脉移植不同基因修饰的rBMSCs,特别是NGF和Noggin联合修饰的rBMSCs能有效改善MCAO大鼠神经功能活动。移植细胞能在梗塞区及其周边脑组织存活,并分化为具有神经元或星形胶质细胞表型的细胞。移植能促进MCAO大鼠梗塞周边脑组织VEGF和突触素表达,这说明移植能促进缺血脑组织血管新生以及脑组织重塑。